沙蚕激酶全基因在大肠杆菌中表达及溶栓作用检测

1 / 7沙蚕激酶全基因在大肠杆菌中表达及溶栓作用检测【摘要】 目的 使沙蚕激酶全基因在大肠杆菌中高效表达获得沙蚕激酶，并检测其溶栓活性。方法 通过BamH和 EcoR双酶切将沙蚕激酶全基因克隆进载体pGEX4T-2，诱导表达后 SDS-PAGE 证实该基因正常表达。构建大鼠颈动-静脉旁路血栓模型，进行目的蛋白溶栓作用检测。结果 沙蚕激酶使血栓湿质量减小，优球蛋白溶解时间缩短，但对纤维蛋白原影响不明显(F=，P)。结论 沙蚕激酶基因表达的目的蛋白有抑制血栓形成、激活纤溶活性的作用。 【关键词】 沙蚕激酶 基因表达 纤维蛋白溶解 大鼠 ABSTRACTObjectiveTo obtain nereis kinase by effective expression of nereis kinase whole-gene in E. coli， and detect its thrombolytic kinase gene whole-gene was cloned into vector pGEX4T-2 by double-enzyme cut with BamH & EcoR, the gene was confirmed to be normal. A rat carotid artery-vein-bypass-thrombus model was established to determine the thrombolytic effect of the interest wet weight of thrombus decreased and ELT shortened 2 / 7(F=, ;P).ConclusionThe interest protein expressed by nereis kinase gene has the effects on inhibiting thrombopoiesis and activating thrombolytic activity. KEY WORDSNereis kinase; Gene expression; Fibrinolysis; Rats 近年来，血栓性疾病及其纤维蛋白的溶解已成为严重的医学问题1,2 。溶栓疗法是使已形成的血栓直接溶解的惟一疗法，即利用溶栓剂直接溶解血栓，或通过激活血液中的纤维蛋白溶酶原转化成纤维蛋白溶酶，催化血栓的主要基质纤维蛋白水解。目前, 已从不同途径研发出多种溶血栓剂、抗血栓形成剂和抗凝血剂，如链激酶(SK)、尿激酶(UK)以及其生物工程改造产品,而且已广泛应用于临床治疗中3,4 ；赤子爱胜蚓的体腔液具有强溶血活性,能够直接作用于不同哺乳动物的红细胞5 ；海藻的植物血凝素能抑制血小板的聚集6 。研制和发展高效、特异、安全、不良反应少的溶栓药物，一直是近年来世界范围内的热门课题。本实验室发现沙蚕 Nereis virens 的体腔液具有纤维蛋白水解活性,推测与体内的纤溶酶有关,并进行了相关研究，成功地从沙蚕消化道上皮细胞克隆到一个具有丝氨酸蛋白酶家族活性位点高度保守序列的基因7 。对其进行了原核表达和溶栓试验研究，现报告如下。 3 / 71 材料和方法 材料 基因、酶、试剂与载体 沙蚕激酶基因为青岛大学医学院医药生物技术重点实验室专利基因；PCR 试剂,限制性核酸内切酶 EcoR、BamH，纤溶酶原,牛凝血酶,牛纤维蛋白原(FIB)购自 Sigma 公司；尿激酶为烟台绿叶制药有限公司产品；表达用载体 pGEX4T-2、菌株 DH5 由本室保存。肝素钠为万邦制药有限公司产品，蚓激酶肠溶胶囊为青岛国大药业有限公司产品；其他化学试剂均为分析纯。 实验动物 Sprague Dawley 大鼠，雌雄兼用，体质量200250 g，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，许可证号:scxkXX-0007。 沙蚕激酶的表达方法 PCR 获得全长编码序列 按照沙蚕激酶基因编码序列设计上下游引物：P1；P2。PCR 扩增后通过 BamH和 EcoR酶切将该序列克隆入 pGEX4T-2 Vector，转化感受态大肠杆菌 DH5，酶切鉴定后将阳性克隆送至上海生工公司测序以确保准确性。 目的蛋白的表达及纯化 将上述已测序的包含目的克隆的菌株接种到 ALB 平板复苏，次日挑取单个转化菌菌落，接种于 ALB 培养液 5 mL 中，37 培养过夜，次日取培养4 / 7物按 1100 比例接种于新鲜 ALB 培养液中，37 振荡培养至 A600 约，加 IPTG 至 1 mmol/L，置 37 诱导培养 3 h，收集菌体。将菌体用 PBS 洗涤 2 次，超声处理，分别收集上清，将上清中加入 GST fusion protein purification beads 振荡 30 min 纯化浓缩上清中的蛋白，进行 SDS-PAGE检测。同时，将浓缩纯化后的上清蛋白加凝血酶 22 酶切814 h,得到纯化的目的蛋白。 沙蚕激酶溶栓检测 分组及给药设计 将 SD 大鼠 40 只随机分为 5 组：生理盐水对照组，沙蚕激酶粗提物低剂量组( mg/kg)、中剂量组、高剂量组( mg/kg)，蚓激酶阳性对照组 (3 750 U/kg),以上各组均十二指肠注射给药。 动-静脉旁路血栓模型制备 将 SD 大鼠用 80 g/L 水合氯醛按 500 mg/kg 剂量腹腔注射麻醉，背位固定，分离左侧颈外静脉和右侧颈总动脉。在三段聚乙烯管中段放入一段长 6 cm 的 4 号手术丝线，聚乙烯管内充满肝素生理盐水溶液(5104 U/L)。用聚乙烯管的一端插入左颈外静脉后，由聚乙烯管准确注入肝素生理盐水溶液(50 U/kg)抗凝，然后再将聚乙烯管的另一端插入右颈总动脉，打开动脉夹，血液从右颈总动脉流至聚乙烯管内，返回左颈外静脉，形成颈动-静脉旁路。 血栓湿质量的测定 制作动-静脉旁路血栓模型后，十5 / 7二指肠注射给药, h 后，腹主动脉取血，阻断右颈总动脉和左颈外静脉血流，迅速取下聚乙烯管，取出手术线，放在滤纸上用电子天平测定质量，以总质量减去线质量，即血栓湿质量。 优球蛋白溶解时间测定 取 9 份全血与 1 份 38 g/L 枸橼酸钠溶液混合，然后立即以 3 000 r/min 离心 10 min，分离出无血小板血浆。取血浆 mL，加 mL 蒸馏水，再加体积分数为的醋酸溶液 mL,使 pH 值为，充分混合后，将混合液置于 4 冰箱内 10 min，使优球蛋白沉淀，再以 3 000 r/min 离心 5 min,弃去上清液，将沉淀管倒置滤纸上吸去多余液体。加入硼砂缓冲液 mL 于离心管中，用玻璃棒搅匀约 1 min。将试管置于 37 水浴中，2 min 之后加入 mol/L 的 CaCl2 溶液 mL，使其凝固，形成优球蛋白凝块，开始记录优球蛋白凝块完全溶解成水溶液的时间。 血浆 FIB 的检测 利用 SINNOWA D-360 全自动生化分析仪对血浆中 FIB 含量进行检测。 统计学处理 应用 SPSS 软件包处理，组间比较采用方差分析。 2 结 果 重组表达载体的鉴定 采用 BamH和 EcoR酶切重组表达载体 pGEX4T-2-沙蚕激酶基因，同时以 P1 和 P2 为引物进行 PCR 和酶切鉴定，6 / 7在 249 bp 处均出现一条明显的条带，与测序结果提供的碱基数一致。见图 1。 沙蚕激酶蛋白电泳检测 沙蚕激酶相对分子质量约 9 000，GST 蛋白相对分子质量为 26 000，因此二者形成的融合蛋白相对分子质量为 35 000。图 2 中所示蛋白条带与之相符合，说明沙蚕激酶基因已经正常表达。 溶栓检测结果 与生理盐水对照组比，沙蚕激酶粗提物可使血栓质量明显减小，且呈现剂量依赖关系，其中高剂量组作用明显强于低、中剂量组和蚓激酶阳性对照组(F=,P)。见表 1。表 1 沙蚕激酶粗提物对大鼠血栓湿质量、ELT 和 FIB 含量的影响 3 讨 论 鉴于天然合成的抗血栓药物的副作用较大，目前许多国家都在试图从天然动植物和微生物中寻找抗血栓药物8 。丝氨酸蛋白酶家族依据其一级结构中催化位点附近氨基酸的不同，可分为不同的亚家族，包括似糜蛋白酶亚家族(SA)、似枯草溶菌酶亚家族(SB)和似 / 水解酶亚家族(SC)。各亚家族在其催化活性中心 Ser、His 和 Asp 附近均有高度保守的氨基酸序列。来自真核生物的具有消化和纤溶活性丝氨酸内肽酶属于 SA 亚家族，在其催化活性中心 Ser 附近7 / 7有高度保守的“GDSGGP”氨基酸序列。利用青岛大学医学院医药生物技术重点实验室专利基因 249 bp 的沙蚕激酶基因，将其克隆入原核表达载体 pGEX4T-2，并在相应的宿主菌中进行诱导表达，获得 GST