消瘤保肺丸对人肺癌pg细胞上皮细胞钙粘蛋白、α

1 / 7消瘤保肺丸对人肺癌 PG 细胞上皮细胞钙粘蛋白、作者：孙宏新 段铮 蒋艳玲 王玲玲 周世繁【摘要】 目的研究消瘤保肺丸对上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)、-catenin 及 -catenin 在人肺癌 PG 细胞株中表达的影响及其意义。方法采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法(SP 法)检测人肺癌 PG 细胞 E-cadherin、-catenin 及 -catenin 在消瘤保肺丸干预作用下的表达情况。随机分为 4 组即消瘤保肺丸高剂量组、消瘤保肺丸低剂量组、清肺化痰丸组和空白组。结果 E-cadherin 与 -catenin、-catenin 在消瘤保肺丸作用下阳性表达率不同，其中 E-cadherin 在消瘤保肺丸的影响下阳性表达率较低，明显低于清肺化痰丸组和空白(P 【关键词】 消瘤保肺丸; 上皮细胞钙粘蛋白; -连接素; -catenin; 人肺癌 PG 细胞; 免疫组化法肺癌患者的肿瘤转移是导致其死亡的重要原因之一。粘附是肿瘤转移过程中的一个关键环节，粘附因子在其中发挥着不可或缺的作用。上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)是一类细胞粘附的跨膜糖蛋白，是维持上皮细胞形态及同种细胞间粘附连接的主要粘附分子，E-cadherin 借助于-连接素(-catenin)连接在 E-cadherin 与 -catenin2 / 7之间，大量的实验证实 E-cad/catenins 复合物介导的细胞同质粘附具有抑制肿瘤侵袭、转移的作用1,2。我们针对该环节，研究消瘤保肺丸含药血清对 E-cadherin、-catenin 及 -catenin 表达水平的影响，以探讨中药抗癌转移的作用机制。1 材料与仪器药物消瘤保肺丸，该药由河南省中医院院内制剂室提供，批号：XX0514;清肺化痰丸，昆明中药厂有限公司，国药准字 Z53020763，批号：080119。动物及瘤株日本大耳白兔 8 只，购于河南省动物实验中心;PG 细胞(即人高转移性巨细胞肺癌细胞株)，由北京广安门医院肿瘤实验室提供。试剂 RPMI-1640 培养基，美国 Gibco 公司，编号1313945;优级胎牛血清，天津 TBD 公司，编号 Df-1055;E-cadherin 抗体，美国 Santa cruz 公司，编号 MSC8426;-catenin 抗体，美国 Zymed 公司，编号 80900705;-catenin 抗体，美国 Santa cruz 公司，编号 D0708;免疫组化 SP-9002 试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司，编号 51182001;DAB 显色试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司，编号 375230AJ。仪器 二氧化碳培养箱 HF90 型，上海力新 HEAL FORCE;电热恒温培养箱 HH-B11-600 型，国营创新医疗器械3 / 7厂;生物显微镜 XSP-8F 型，广西梧州中康贸易有限公司;倒置显微镜 CK40，日本 Olympus 公司;电动离心沉淀机，大连医疗器械厂，LD-6-4。2 方法动物分组、模型建立与含药血清制备 8 只健康日本大耳白兔，随机分为消瘤保肺丸高剂量药物组、低剂量药物组，清肺化痰丸对照组、空白组 4 组(依次简称为消高组、消低组、清肺组、空白组，以下同)，每组 2 只，每组每天早晚各给药 1 次，每次 10 ml/kg，其中高、低剂量组分别相当于人等效剂量的 10、5 倍，空白组给以等量生理盐水，连续给药 3 d。取兔血制备为含药血清，具体制备过程参照文献3。细胞培养、给药复苏 PG 冻存细胞，培养基选用含20%优级胎牛血清的 RPMI-1640 培养基，隔日或每日换液 1次，选对数生长期细胞至基本贴满下壁，细胞传代，每培养瓶中加 2 ml 的%胰蛋白酶液使细胞脱壁，加入 8 ml 培养基，反复吹打后分入 5 ml 至新培养瓶。 将干净盖玻片放于培养皿，% 多聚赖氨酸液浸泡 24 h，PBS 缓冲液浸泡 2 s 后取出放入 6 孔板，每孔一张玻片。向每瓶加% 胰蛋白酶液使细胞脱壁，分别加入 20% 消高组、消低组、对照组及空白组培养基，将细胞浓度调至4 / 72106/L 制成细胞悬液，每组加入一 6 孔板中，每孔加入1 ml 细胞悬液，放 37 CO2 培养箱培养 48 h。第 3 天观察细胞贴壁状态，取出盖玻片，经 10%多聚甲醛固定 20 min 后免疫组化用。免疫组化 SP 法参照试剂操作说明书:在盖玻片上滴加去离子水(H2O2)1 滴，常温放置湿盒中 30 min。PBS 缓冲液浸泡 3 次，5 min/次。滴加山羊封闭血清 1 滴，常温放置湿盒中 30 min。甩掉血清，滴加目的一抗 1 滴，放湿盒中置 4冰箱过液。PBS 缓冲液浸泡 3 次，5 min/次。滴加二抗工作液 1 滴，放湿盒中置 37电热恒温培养箱孵育 15 min。PBS 缓冲液浸泡 3 次，5 min/次。滴加链霉卵白液 1滴，放湿盒中置 37电热恒温培养箱孵育 15 min。PBS 缓冲液浸泡 3 次，5 min/次。DAB 显色剂加 12 滴染色 30 s，观察染色情况。清水冲洗 10 min。苏木素加 1 滴染色 5 min，清水冲洗 10 min。盐酸酒精分化 2 s，显微镜下观察，苏木素染色不满意可复染。细胞按 50% 乙醇，70% 乙醇，95% 乙醇，无水乙醇的顺序脱水，每个浓度中浸泡 5 min(无水乙醇分别浸泡两次)。二甲苯浸泡 2 次，每次 5 min。中性树胶封片于载玻片上。判断方法 依据阳性细胞所占比例分为 3 个等级：阴性(-)，细胞膜无棕色染色或细胞膜染色阳性细胞数 50%。随机取 10 个高倍镜下视野，判断每个视野下细胞表达情况5 / 7并记录。见图 13。a?PG 细胞消瘤保肺丸高剂量组 b?PG 细胞消瘤保肺丸低剂量组c?PG 细胞清肺化痰丸组 d?PG 细胞空白组图 1 E-cadherin 在肺癌 PG 细胞各组的免疫组化表达(SP,400)a?PG 细胞消瘤保肺丸高剂量组 b?PG 细胞消瘤保肺丸低剂量组c?PG 细胞清肺化痰丸组 d?PG 细胞空白组图 2 -catenin 在肺癌 PG 细胞各组的免疫组化表达(SP,400)a?PG 细胞消瘤保肺丸高剂量组 b?PG 细胞消瘤保肺丸低剂量组c?PG 细胞清肺化痰丸组 d?PG 细胞空白组图 3 -catenin 在肺癌 PG 细胞各组的免疫组化表达(SP,400)统计学处理采用 SPSS 统计软件处理，等级资料，以阴性、弱阳性及阳性表达的视野个数分别表示。统计方法选用秩和检验。3 结果见表 1 表 1 人肺癌 PG 中 E-cadherin、-catenin及 -catenin 阳性表达的视野个数统计6 / 74 讨论消瘤保肺丸是从众多方药中筛选出的有效方剂，由浙贝母、蜂房、北沙参、南沙参、黄芪等药物组成，功能化痰止咳、益气养阴、抗癌解毒。其中浙贝母清热化痰止咳、散结消痈;半夏不仅除湿化痰、发表开郁、降逆止呕，且具有消淤止血、消肿散结之功4。两药合用可使痰化郁开而咳止，同时兼具止血之功，黄芪补气升阳、益卫固表，补肺气之不足;南沙参、北沙参养阴清肺，益胃生津，可使肺热得清，阴津滋生，与黄芪共达气阴双补之功;百合、麦冬滋阴益肺，滋而不腻，补而不燥;黄芩清肺止咳;仙鹤草不但可提高机体免疫机能，还可防治肺癌咳血5。前期实验证实消瘤保肺丸能提高免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞的功能，临床观察表明可以提高机体免疫功能， 配合化疗可提高临床疗效， 减轻化疗引起的骨髓抑制6。本实验表明，消瘤保肺丸含药血清对粘附分子在人肺癌 PG 细胞中的表达均有影响，且 P 另外，我们不能忽略清肺化痰丸组在某些分子的表达中亦与空白组有显著差异。纵观二药，消瘤保肺丸与清肺化痰丸的组成均以化痰