载体构建操作流程

载体构建操作流程 一 载体准备 1 质粒准备 电泳检测载体质量 好的质粒为三条带 分别是超螺旋 开环和复制中间体 即没有复制完全的两 个质粒连在了一起 也有观点认为是质粒两条链没有断裂的超螺旋结构 开环 DNA 和线性 DNA 超螺旋结构应至少占到 90 测定质粒浓度 用核酸定量仪测定质粒的浓度 A230 A260 和 A280 值 2 质粒双酶切 根据需要的酶切位点 选择对应的酶 查找适合的 Buffer 进行单酶切 以 TaKaRa 的限制酶为例 双酶切的体系如下 试剂 体积 质粒 1 g Enzyme I1 L Enzyme II1 L 10 X Buffer 2 L 灭菌水 to 20 L 总体积 20 L 将上述体系置于 37 不同酶可能存在差异 水浴锅中酶切 根据酶切效率不同确定酶切时间 可以去除 2 l 进行电泳检测 3 回收质粒 凝胶回收 参照 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 3 0 试剂盒说明书 1 称量胶块重量 计算胶块体积 计算胶块体积时 以 1mg 1 l 进行计向胶 块中加入胶块融化液 Buffer GM 我们一般用 1 的琼脂糖凝胶电泳 所以 一般加入 3 个凝胶体积量 2 均匀混合后室温 15 25 融化胶块 此时应间断振荡混合 使胶块充分融化 约 5 10 分钟 3 将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上 将上述操作的溶液转 移至 Spin Column 中 12 000 rpm 离心 1 分钟 弃滤液 滤液再加入 Spin Column 中离心一次 可以提高 DNA 的回收率 4 将 700 l 的 Buffer WB 加入 Spin Column 中 室温 12 000 rpm 离心 30 秒钟 弃滤液 5 重复操作步骤 6 将 Spin Column 安置于 Collection Tube 上 室温 12 000 rpm 离心 1 分钟 7 将 Spin Column 安置于新的 1 5ml 的离心管上 在 Spin Column 膜的中央处 加入 30 l 的灭菌蒸馏水或 Elution Buffer 室温静置 1 分钟 8 将灭菌蒸馏水或 Elution Buffer 加热至 60 使用时有利于提高洗脱效率 9 室温 12 000 rpm 离心 1 分钟洗脱 DNA 4 检测 取 1 l 凝胶回收产物进行琼脂糖凝胶电泳 检测条带大小与目的大小是否一致 用核酸定量仪测回收片段的浓度 二 插入片段准备 1 两端带有酶切位点的 PCR 产物 如果设计的扩增目的片段的引物带有酶切位点及相应的保护碱基 可以采用限 制酶进行双酶切 具体参考质粒双酶切的体系及鉴定方法 2 寡核苷酸 包括 shRNA 和 linker 如果要构建 shRNA 载体 那么需要合成 shRNA 上下游寡核苷酸引物 引物回来之后 首先根据说明书上提供的信息 用水溶解到终浓度为 1 g l 引物退火 试剂体积 F2 R2 H2O46 在 PCR 仪上进行引物退火 退火体系设置为 90 3min 37 1hr 结束之后马上进行连接 或者冻到 20 保存 三 连接 我们实验室采用的是 Fermentas T4 DNA Ligase EL0014 kit 1 粘性末端连接 按照下面体系进行加样 ComponentAmount Linear vector DNA20 100 ng Insert DNA molar ratio over vector 1 1 to 5 1 10X T4 DNA Ligase Buffer 2 l T4 DNA Ligase 5 u l 1 u 0 2 l Water nuclease freeto 20 l Total volume20 l 在 PCR 仪中 22 孵育 10min 可根据片段大小适当调整连接时间 取 5 l 连接产物进行转化 50 l 感受态细胞 剩下的保存备用 2 钝性末端连接 按照下面体系进行加样 ComponentAmount Linear vector DNA20 100 ng Insert DNA molar ratio over vector 1 1 to 5 1 10X T4 DNA Ligase Buffer 2 l T4 DNA Ligase 5 u l 5 u 1 l 50 PEG 4000 Solution2 l Water nuclease freeto 20 l Total volume20 l 在 PCR 仪中 22 孵育 1 hr 可根据片段大小适当调整连接时间 取 5 l 连接产物进行转化 剩下的保存备用 3 载体连接 linker 按照下面体系进行加样 ComponentAmount Linear vector DNA100 500 ng 磷酸化的 linker1 2 g 10X T4 DNA Ligase Buffer 2 l T4 DNA Ligase 5 u l 2 u 0 4 l 50 PEG 4000 Solution2 l Water nuclease freeto 20 l Total volume20 l 充分混匀 短暂离心后 放在 PCR 仪中 22 孵育 1 hr 65 放置 10min 使酶失 活 取 5 l 连接产物进行转化 剩下的保存备用 四 转化 按照 DH5 说明书进行 操作步骤 1 取感受态细胞置于冰浴中 一次转化感受态细胞的建议用量为 50 100 l 可 以根据实际情况分装使用 以下实验以 100 l 感受态细胞为例 2 待感受态细胞融化后 向感受态细胞悬液中加入目的 DNA 根据实际情况 加入适量的 DNA 通常 100 l 感受态细胞能 够被 1 ng 超螺旋质粒 DNA 所饱和 用移液器轻轻吹打混匀 冰浴 30 分钟 3 42 热击 90 秒 迅速将离心管转移到冰浴中 冰上静置 2 3 分钟 4 向每个离心管中加入 900 l 无菌的 SOC 或 LB 培养基 不含抗生素 混匀 后置于 37 摇床 150rpm 振荡培养 45 分钟使 菌体复苏 5 取 100 l 已转化的感受态细胞 加到含相应抗生素的 SOC 或 LB 固体琼脂培 养基上 用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开 直至干燥 倒置平板 37 培养 12 16 小时 注意 1 涂布用量可根据具体实验调整 若转化的 DNA 总量较多 可取少 量转化产物涂布平板 若转化的 DNA 总量较少 可取 200 300 l 转化产物涂布 平板 若预计的克隆数较少 可通过离心 4 000 rpm 2 分钟 后吸除部分培 养液 悬浮菌体后将其涂布于平板中 2 新制备的固体培养基不易涂干 可将平板正置于 37 直至液体被吸收后再 倒置培养 3 涂布剩余的菌液可置于 4 保存 如果次日的转化菌落数过少 可以将剩 下的菌液再涂布新培养基进行培养 注意事项 1 转化所有步骤均在无菌条件下操作 2 感受态细胞应在 80 下保存 不可多次冻融和放置时间过长 以免降低感受 态细胞的转化效率 3 包装中有 0 1 ng l 的 pUC19DNA 供对照试验使用 4 一定要使用与质粒载体对应的抗生素 五 挑单克隆 一般培养 8 9 个小时即可看到小的菌落 培养 12 个小时即可挑单克隆 一般培 养 16 个小时即可放到 4 保存 挑菌 1 待平板的菌落长至足够大达到可挑的水平 2 在超净工作台中 在灭菌过的试管内倒入 5 10 mL 灭过菌的培养基 培养基 根据需要预先加入抗生素 由菌落所携带的质粒上的抗性基因所决定 注意抗 生素要按比例加入培养基 并要清楚标记 未用完的培养基要及时放回 4 冰 箱 3 用镊子夹取灭菌的牙签挑取平板上的单菌落 在试管内的培养基中蘸洗几下 旋紧管盖后再将牙签丢弃于台外的收集箱中 注意挑菌时不提倡将牙签直接投 入培养基中 挑菌时一定要挑清晰正常的单菌落 挑过菌的牙签一定不要留在 超净工作台中 4 挑菌后请将装灭菌牙签的小烧杯封好 并及时清理工作台面 5 接种过菌落的试管在摇床中合适的温度下摇动培养 摇速一般为 170 230 r min 注意试管要在摇床上放好 有适当的倾斜角度 45 左右 不同的菌 株和摇菌目的需要不同的温度和摇速 六 克隆鉴定 1 菌液 PCR 使用普通的 PCR 体系 每管加入 1 l 菌液进行 PCR 注意事项 引物选择 使用掺入片段的全长引物 定量引物 两端通用引物 通用引物与 定量引物交叉使用 菌落的处理 一般摇 4 个小时即可进行鉴定 PCR 体系 一般用 20 或 25 l 体系 用普通体系即可 如果片段长达大于 2000 可选用 TaKaRa LA Taq 体系 模板量 一般加