AtheNA中文讲座

Luminex流式免疫荧光技术在自身免疫及优生免疫疾病诊断中的应用 上海一滴准生物科技有限公司,第一部分,介绍与Luminex技术相关的公司1， 美国路明克斯公司2， 美国宙斯公司3， 上海一滴准生物科技有限公司,1995年成立座落于美国德克萨斯州,唯一通过美国FDA认证的高通量诊断技术 唯一被纳入美国临床实验室质控网络的高通量诊断技术,2000年在美国纳斯达克上市,2008-2009 年评为美国25家成长最快的 高科技公司,流式荧光技术发展历程简介,2001年7月27日 INOVA基于该技术的“QUANTA PLEX ENA PROFILE4” 通过了美国FDA认证2005年6月9日 Nature发表基于该技术的有关microRNA和癌症关系的学术论文2005年11 月 流式荧光技术获得年度国际临床诊断技术革新奖2009年 基于Luminex技术平台，有53种产品，约300种指标通过了美国FDA认证,目前，全球有包括Abbott、Bayer、ZEUS、Bio-Rad等公司在内的共50多家公司加盟流式荧光技术联盟，合作开发和推广流式荧光产品，已经有50个产品300多个指标通过了美国FDA的严格认证进入临床使用。,Zeus公司成立于1976年总部设在美国新泽西州Zeus公司自成立开发序列免疫荧光诊断试剂盒1984年被授予里根总统奖及出口最多国家奖1987年开始开发ELISA诊断试剂盒并相继得到FDA认证2000年和Luminex合作开发系列诊断试剂盒,第二部分,标记抗体,待测标志物,交联有抗体的编码微球,流式免疫荧光应用于免疫检测原理示意图,基因检测过程原理示意图,标记荧光素,待测PCR扩增片段,交联有基因探针的编码微球,第三部分,Zeus应用Luminex技术介绍,Zues流式免疫荧光检测系统介绍,全自动流式荧光检测系统特点：全自动，自动识别样品，试剂，自动实验检测，结果对接LIS半自动流式荧光检测系统特点：流式荧光最后结果读数，数据分析结果对接LIS，价格便宜。流式荧光诊断试剂盒特点：利用Luminex技术和孔内定标专利技术，在节省人力，物力，时间同时，大大提高试剂盒线性范围，灵敏度，准确性。,Zues流式免疫荧光检测系统技术介绍,编码微球（原始编码微球最多100种），链接一个羧基残端，有利于蛋白结合更牢靠。购买自Luminex公司流式免疫荧光检测系统购买自Luminex公司流式荧光诊断试剂盒Zues利用购买自Luminex编码微球，根据临床诊断需要开发不同类型组合诊断试剂盒。,Zues购买编码微球Luminex公司编码方法？,待编码的微球为直径为5.6 um聚苯乙烯材质大小均一微球微球的编码方法：使用两种荧光染料：一红一红外在有机溶剂中，两种荧光染料按精确的比例混合聚苯乙烯微球在有机溶剂里膨胀，混合染料扩散到微球内部。冷却后，微球从内到外染色。什么是微球编码：红色和红外荧光染料的比例就是微球的编码，可达100种。,Zues流式免疫荧光检测系统反应原理示意图1,反应完成后微珠放大微珠标记Y和藻红蛋白标记Y夹心检测黄色待检物。多个项目在同一个反应杯中反应示意图 多个项目在同一个反应杯中反应示意图,Zues流式免疫荧光检测系统反应原理示意图2,多个项目在同一个反应杯子反应示意图多个项目在同一个反应杯子反应示意图多个项目多个样品反应示意图,Zues流式免疫荧光检测系统检测时仪器内部图片,微珠排成线状通过检测区红激光和绿激光照射检测区的微珠微珠因红激光和绿激光照射而发射三种波长荧光。,Zues流式免疫荧光检测系统检测原理示意图,微珠排成线状通过检测区，每秒可以检测32000个以上的微珠仪器检测微珠的四个指标：微珠直径，红色荧光，红外荧光，藻红蛋白荧光确定是否为有效微珠和待检测物质含量。,Zues流式免疫荧光检测系统检测微珠编码数据及分析,Zues流式免疫荧光检测系统检测项目藻红蛋白荧光值,Zues流式免疫荧光检测系统检测时仪器的实时图片1,Zues流式免疫荧光检测系统检测时仪器的实时图片2,ANA10项检测完经AtheNA软件分析定性结果,ANA10项检测完经AtheNA软件分析定量结果,ANA10项检测完经AtheNA软件分析CVS结果,ANA10项检测完经AtheNA软件分析LIS结果,第四部分,Zeus流式免疫荧光检测方法学归类,蛋白检测常用方法优缺点比较,蛋白检测常用方法精密度比较数据及示意图,放射免疫精度：10-12mol/L 酶联免疫精度：10-9 mol/L 化学发光精度：10-15mol/L 电化学发光 精度：10-17mol/L 时间分辨荧光精度：10-18mol/L,Zues流式免疫荧光检测方法优于电化光蛋白检测方法,流式荧光检测系统检测激光激发藻红蛋白荧光量跟待检物成非线性正比关系。类似电化光的分析方法，具有检测线性范围宽，灵敏度高，稳定，重复性好，操作简单等特点之外，还具有高通量，样本用量少，平台开放，可以检测项目多，仪器试剂价格相对低等众多特点。因此流式荧光检测方法是类似但优于电化光的检测方法。,第五部分,Zeus应用Luminex技术开发AtheNA产品的优点,Zeus 流式免疫荧光试剂盒AtheNA系列 优点1,流式荧光检测方法是类似但优于电化光的检测方法。具有检测线性范围宽，灵敏度高，稳定，重复性好，操作简单等电化光优点。还具有高通量，样本用量少，平台开放，可以检测项目多，仪器试剂价格相对低等众多优点。,Zeus 流式免疫荧光试剂盒AtheNA系列 优点2,=,AtheNA试剂采用XMAP技术（多指标并行检测），左边一盒AtheNA试剂盒相当于右边10盒传统方法检测试剂，有效减少试剂储存所需要的冷藏空间。,Zeus 流式免疫荧光试剂盒AtheNA系列 优点3,1，AtheNA样品用量10ul即可检测10-100项目，其他方法需要10-100倍它的样品量。2，AtheNA样品用量少减少病人因采样多带来的痛苦，易采集，有利于稀有样品检测，减少样品因分配不同工作站检测污染带来的结果不准。,Zeus 流式免疫荧光试剂盒AtheNA系列 优点4,2.5T=20T,用AtheNA诊断试剂，一个技术员在2.5小时内可以完成96个样本的检测分析，每个样本分析项目数量可以10项或更多达到100项。用传统方法，96样本，每个样本分析10个项目，至少需要20小时。用AtheNA诊断试剂，不仅避免传统方法的操作复杂繁琐，而且由于实验操作简单统一，更易于实现自动化.用AtheNA诊断试剂，分析数据直接和LIS系统对接，上传医院LIS数据库.,Zeus 流式免疫荧光试剂盒AtheNA系列 优点5,ELISA反应模式：反应只局限在孔的底部及四周。模条反应模式：反应只局限在底部。Luminex反应模式：动态液态反应模式，比以上两种更易于达到反应平衡点。,Zeus 流式免疫荧光试剂盒AtheNA系列 优点6（微珠单项）,=,AtheNA1个孔1项目所测数值相当于ELISA1项重复做50次的数值类均相反应，反应模式保证了重复性每个指标有10005000个反应单元分析50个有效微球中位值，检测模式是重复性的第二道保险CV 5%,Zeus 流式免疫荧光试剂盒AtheNA系列 优点7（微珠10项）,=,AtheNA1个孔10项目所测数值相当于ELISA10个单项重复做50次的数值类均相反应，反应模式保证了重复性每个指标有10005000个反应单元分析50个有效微球中位值，检测模式是重复性的第二道保险CV 5%,Zues在Luminex技术基础上进行技术创新,Zeus创新全自动流式荧光仪，自动识别样品，试剂，自动实验检测，结果对接LIS系统。Zeus针对Luminex的AtheNA系统进行创新样品稀释液人性化设计采用加样变色技术发明孔内定标技术（专利技术），提高试剂盒准确性。AtheNA试剂盒有良好质量控制系统，配备的操作误差质控品和孔内定标微球，确保检测值的准确。,Luminex检测技术介绍,Luminex检测时，把液体吸进仪器微珠成单线排列通过检测区进行检测，虽然检测很快，但由于微珠的无序排列，15种微球一个孔大概需要35秒。Luminex为液相反应模式，在检测时，反应并未终止，还可以与提供液体环境的标记物反应。因此就会如右图，同一样本随检测时间推后，MFI值会增加。,Zeus 在Luminex技术基础创新1 （全自动系统）,全自动，自动识别样品，试剂，自动实验检测，结果对接LIS打印检测报告。,Zeus 在Luminex技术基础创新2 （加样变色技术）,样本稀释液本为黄色，加样本后变蓝色。可有效防止样本的错加和漏加。,ELISA定量检测试剂盒如何定量,ELISA定量试剂盒定量方式是在开始选择几个孔来做定量标准曲线。以递增标准浓度作为X轴，OD值作为Y轴绘制标准曲线。所有样本都是在以上的标准曲线上计算得到。,Zeus AtheNA诊断系统采用ELISA定标出现问题？,因为检测MFI在不同检测时间而发生漂移，同一校准曲线计算的结果也会发生漂移。,Zeus AtheNA诊断系统的孔内定标技术（专利技术）,在AtheNA多重微珠检测系统中，每个检测孔都绘制独立标准曲线，该曲线符合该检测孔当时反应条件。,Zeus AtheNA诊断系统经孔内定标计算结果,在AtheNA多重微珠检测系统中，每个检测孔都绘制独立标准曲线，该曲线符合该检测孔的反应条件。因此就有如上图即使反应时间条件不同，也不会产生数据的飘移,Zues在Luminex技术基础上创新 4（全面质控方式）,AtheNA诊断试剂盒提供一套操作过程控制质控品，该质控品为所检测项目定值样本有一定范围，当作样品检测，如不通过仪器有提示更正操作错误得到准确结果。 CAL1，CAL2，CAL3微珠包被梯度羊抗IgG与样品中IgG反应单独绘制标准曲线，平衡因个体差异及加样时差带来误差。BSA排除非特异性吸附带来误差。CAL4包被定量IgG平衡因检测先后带来误差。,AtheNA体外诊断试剂盒产品目录1,AtheNA ANA,AtheNA ANCA,AtheNA RF,AtheNA TPO/TG,AtheNA体外诊断试剂盒产品目录2,AtheNA体外诊断试剂盒产品目录3,ZEUS有SFDA注册证的试剂 自身免疫（ANA 10项)、 ANCA（MPO、PR3、GBM）,配套试剂,TORCH 十项（巨细胞病毒、风疹病毒、弓形虫病毒、单纯疱疹/病毒）、EB病毒四项 、RF 等,明年即将推出的试剂 ANA 16项、过敏原20多项、肿瘤标志物 、细胞因子 等,AtheNA诊断试剂盒的组成成份,1,样本稀释液1瓶(50 mL)2,混合微珠1瓶 (5.5 mL)3,荧光二抗标记物 (16 mL)4,操作质控品(0.25 mL)5,洗涤缓冲液1瓶(50 mL)6,稀释盘1个7,反应盘1个8,试剂包（标签卡及说明书）1份9,校准 CD,AtheNA诊断试剂盒操作步骤,第1步：1:21 样本稀释第:2步：加 10 l 稀释样本到 50 L 混合微珠中，室温放置30 +/- 10 分钟 (20o to 25o C)第3步：用过滤盘洗涤3次。第4步：加150 L 荧光抗体。室温放置30 +/- 10 分钟 (20o to 25o C)第5步：2小时内上机读数第6步:运用AtheNA软件分析检测结果,AtheNA诊断系统优点小结,1，节约时间：一次检测可获得多个检测指标。2，样本用量少：一次检测仅需10ul血清。3，灵敏度高：检测原理为电激发发光检测，灵敏度可达10-17mol/L 4，特异性好：包被物都是纯化的特异性抗原或抗体。5，检测结果清晰：提供定性和定量检测结果。6，检测结果准确性好：试剂盒的参考品数值与国际参考值溯源，并且每个项目检测50个数值的中位值作为分析数值。7，人性化设计：试剂盒样本稀释液在加样本前后有颜色变化，避免样本的漏加或重复加样。8，孔内定标技术：每个检测孔独立绘制一条标准曲线，该样本检测结果根据该曲线和标准值换算得到，有效避免因样本亲和性个体差异带来的误差。,ZEUS试剂与国产试剂的区别,ZEUS具有专利技术-孔内定标，每个检测孔都绘制独立标准曲线，该曲线符合该检测孔的反应条件。即使反应时间条件不同，也不会产生数据的飘移，可保证检测结果准确性及重复性。国产试剂需要孔外定标，受人为、温度、时间等因素影响太多。而且按照每个标本检测时间需要40秒计算，每个标本反应条件就比定标试剂反应试剂延长，随着检测时间延长，标本检测结果会逐渐偏高。,第六部分Luminex技术在其他方面应用,Luminex技术应用领域示意图,Luminex技术应用领域,免疫学分析细胞因子检测受体配体分析酶分析蛋白质蛋白质相互作用分析蛋白质DNA相互作用分子核酸研究SNP检测基因表达谱分析,Luminex检测配套试剂盒,R&D: Fluorokine MAP系列，主要检测各种细胞因子及MMP系列蛋白Biosource：各种细胞因子、生长因子系列Upstate: Beadlyte系列，主要检测细胞因子/趋化因子、信号转导相关蛋白及激酶的活性Linco：各种细胞因子和趋化因子检测Cayman：检测前列腺素E2,R&D配套Luminex试剂盒,human IFN- ghuman IL-2human IL-4human IL-5human IL-6human IL-10human IL-17human TNF-ahuman TNF-Human CCL系