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文档简介

1 PCR 单链构型多态性分析 SingleStrandConformationPolymorphism SSCP 2 什么是PCR SSCP PCR SSCP是在完成靶DNA的PCR扩增之后进行单链DNA多态性分析的一种新方法 将单链的扩增DNA或组织基因组DNA通过中性的聚丙烯酰胺凝胶电泳 根据其电泳位置的改变可分辨出单个碱基的改变 3 SSCP原理 在SSCP凝胶中电泳时 单链DNA的泳动速率主要取决于二级空间结构 因此若DNA片段中碱基发生突变 将会引起单链DNA二级空间结构的改变 使SSCP凝胶上出现异常移动的电泳带 即SSCP阳性 4 5 6 PCR SSCP操作步骤 1 常规PCR扩增DNA片段或其他被标DNA片段的提取 2 将提取的DNA在20 l变性溶液 95 甲酰胺 1mmol LEDTA 0 05 溴酚蓝 0 05 二甲苯青 95 10分钟 冰浴3分钟 3 将混合液加到中性的聚丙烯酰胺凝胶板孔中 在含1xTBE的电泳液中 电泳 4 将凝胶中DNA片段转移到硝酸纤维薄膜上 烘干后以放射自显影拍摄记录 或银染色 7 银染原理 根据核酸分子带有多个氨基和亚氨基 一定条件下可以与银离子结合 在甲醛等还原剂的作用下 形成黑或褐色的银沉淀条带 8 银染过程 凝胶10 乙酸 30 乙醇固定10min0 1 AgNO3染色10min2 5 碳酸钠 0 03 甲醛显色1 乙酸终止dH2O漂洗 dH2O漂洗两次 dH2O漂洗两次 9 影响PCR SSCP的因素 1 DNA片段大小2 复制错误发生3 电泳条件 1 丙烯酰胺的浓度 2 交联剂的浓度 3 电泳的物理环境 4 甘油浓度 10 PCR SSCP与RFLP比较 无需特殊的限制性内切酶作用可测出理论上任何一个碱基突变位点操作简便 无需特殊的仪器设备及试剂电泳条件的改变容易影响SSCP 11 PCR SSCP的应用 1 基因点突变的监测2 多态性检测3 外显子的
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