课程设计范例 不同启动子对RNA介导的病毒抗性的影响

山东农业大学山东农业大学 生生物物技技术术课课程程设设计计 题目 题目 不同启动子对 RNA 介导的病毒抗性的影响 姓名 姓名 学号 学号 年级 年级 专业 专业 指导教师 指导教师 山东农业大学生命科学学院山东农业大学生命科学学院 二二 年年 月月 日日 一 选题依据 拟开展研究项目的研究目的 意义 双链 RNA 导致基因沉默 RNA 干涉 它是一种普遍存在于生物界的生命现象 也是现在生命科学 领域的一个研究热点 尽管对 RNAi 的机制研究已经取得许多重要的成果 但是仍有许多环节需要进 一步地探查 RNA 干涉 RNAi 是利用双链 RNA 特异性的降解相应序列的 mRNA 从而特异性的阻断相应基因的 表达 RNA 介导的病毒抗性技术是利用病毒本身的一些基因导入植物从而获得抗病毒植株 也称为源 于病原诱导的抗病 是植物病毒基因工程常用的策略 马铃薯 Y 病毒 PVY 对马铃薯 烟草等重要经济作物危害十分严重 其侵染所造成的损失可达 80 尤其是马铃薯 Y 病毒坏死株系 PVYN 可以造成寄主提前死亡而绝收 本研究以马铃薯 Y 病毒 外壳蛋白基因 3 端 400bp 的序列为靶目标设计反向重复序列 插入含有三种不同类型启动子的表达 载体 PCAMBIA1300 中 构建 hpRNA 结构的植物表达载体 转化烟草 进行抗病性鉴定 分析不同启动 子对 RNA 介导的病毒抗性的影响 寻找能够引发 RNA 介导病毒抗性产生的最佳类型的启动子 同时探 讨启动子对 RNA 介导病毒抗性的作用本质 二 文献综述内容 在充分收集研究主题相关资料的基础上 分析国内外研究现状 提 出问题 找到研究主题的切入点 附主要参考文献 RNA 干扰 RNA interference RNAi 现象最早是在植物中发现的 1990 年 Napoli 等将查尔酮 合成酶 CHS 基因导入到紫花矮牵牛中 旨在加深花的颜色 但结果花的颜色不但没有加深 而变成 白色或紫白相间 分析发现转基因植株并没有新的基因表达 反而使植物本身的色素合成基因也受到 了抑制 当时将这种现象称为共抑制 Co suppression 或转录后的基因沉默 PTGS 随后 Dougherty 等 1992 年 用烟草蚀纹病毒 tobacco etch virus TEV 的非翻译 CP 基因转化烟草 发 现在表现抗性的植物细胞核中 转入病毒 CP 基因的转录正常 甚至加强 但在细胞质中的积累大大 降低 这与在研究 chs 基因的结果极为相似 也是一种转录后基因沉默 PTGS 这种抗性被称为 RNA 介导的病毒抗性 RNA mediated virus resistance RMVR 继在植物中发现 PTGS 后 目前已在 微生物 动物中也发现与 PTGS 类似的现象 如在真菌内发现的 quelling Guo 1995 线虫 果蝇内 发现的 RNAi Fire 1998 Zamore 2000 根据上述各种基因沉默的特点和性质 可统称为 RNA 干 扰或 RNA 沉默 RNA 沉默是生物体内由双链 RNA double strand RNA dsRNA 引发的同源 mRNA 降解现象 Hammond 2001 Phillip 2002 Kawasaki 2003 在细胞中 dsRNA 在 Dicer 酶的作用下从两端逐段 酶解大小约 21 25nt 的小分子双链 RNA Small interfering RNAs siRNAs 片段 双链 siRNAs 形成 后 与 RNA 诱导的 RNA 沉默复合体 RNA Induced Silencing Complex RISC 结合 在 ATP 酶的 作用下将双链 siRNA 解开成单链 RNA 在 ss siRNA 的引导下 识别与其同源的靶 mRNA 一旦 siRNA 和靶 mRNA 互补配对 RISC 中的核酸酶就将靶 RNA 从 siRNA 中点的对应位置处切断 导 致靶 RNA 降解 RNA 沉默的显著特征是这种沉默作用可以被扩大 这种扩大作用可能是由于反义 siRNA 与靶 mRNA 结合 在 RdRP 的作用下扩增出 dsRNA 然后在 Dicer 的作用下可形成大量的 siRNA 建立 dsRNA 的高效植物表达载体 对于成功地应用 RNAi 技术培育抗病毒的转基因植物起着至 关重要的作用 对于转基因来说 dsRNA 形成的途径的最佳途径是通过构建的发夹结构 hairpin 的外源基因转录产生 具有发夹结构的外源基因由两段反向重复 IR DNA 序列和一段其他 DNA spacer 序列组成 两段 IR DNA 由 spacer 连接起来 这样的结构所转录的 RNA 会形成发夹 结构 hairpin RNA 简称 hpRNA hpRNA 由具有双链结构的 茎 stem 是 IR DNA 转录的产物 配对形成双链 和单链结构的 环 loop 是 spacer DNA 转录的产物 组成 研究发现 在一般的 转基因植物中 即含有非 hpRNA 结构外源基因的转基因植物 产生基因沉默的几率一般为 10 30 而转录后能形成双链 RNA 的转基因 hpRNA 结构的转基因 诱发基因沉默的几率较高 可达到 60 80 以上 尤其对于转录后形成的 环 loop 为内含子的发夹结构 ihpRNA 诱发基 因沉默的效率更高 有的可达 100 朱俊华 2004 竺晓平 2006 Smith 2000 Wesley 2001 Zamore 2002 Helliwell 2003 Pandolfini 2003 基于 hpRNA 表达而诱导的基因沉默已在多种生物 多种基因上获得成功 Smith 2000 Wesley 2001 Piccin 2001 Paddison 2002 Stoutjesdijk 2002 Helliwell 2003 通过对 hpRNA 的研究表明 hpRNA 中的双链 茎 stem 部分是诱发基因沉默的关键部位 茎 的长短可影响 RNA 沉默的效率及稳定性 在植物转基因研究中 Helliwell 2003 等研究发现 50 1000bp 的基因片段均能诱发基因沉默 但基因片段越短 基因沉默的效率越低 并认为片段长 度为 300 600bp 时 是合适的 且可以获得最高的基因沉默效率 在 RNA 介导的病毒抗性研究中 我们的研究结果表明 stem 的长度为 200bp 100bp 和 50bp 的茎长度均可高效的诱导病毒抗性 但 200bp 的效率更高 竺晓平 2006 迟胜起 2005 李鹏 2007 茎长度选择的原则是 在保证足 够效率的基础上 选择尽可能短的片段 这样 第一 可减少外源 DNA 的插入对植物细胞染色体 DNA 造成的不良影响 第二 可进一步提高转基因植物的生物安全性 第三 可很方便地将同一病 毒不同功能基因的 cDNA 区段或不同病毒的 cDNA 连接在同一载体上 从而更高 更持久抗性或多 病毒抗性的植物 从目前已有的研究结果看 较短的适宜茎长度为 300bp 左右 hpRNA 中的 环 loop 也可对 PTGS RNA 沉默 产生影响 loop 的长度直接影响 hpRNA 的形成和稳定性 在一定范围内 短 loop 有利于 hpRNA 的形成和稳定 但 loop 过短会影响 IR 结构 DNA 的在细菌内的克隆 Piccin 等 2001 在研究 hpRNA 引发果蝇 Y 基因 长度为 1120bp 沉默 中的研究中使用 GFP 基因片段为 spacer 结果表明当 loop 长度为 330nt 时 对 dsRNA 引发的 RNAi 无显著影响 且极大地提高了 IR 克隆的效率 而当 loop 长度为 150nt 时 则对提高 IR 克隆的效率 没有帮助 Wesley 2001 等报道 在植物中 当 loop 长度为 30 50nt stem 的长度为 98bp 时 就可引发 100 的基因沉默 我们的研究表明 当 stem 为 200nt 长度时 50nt 长度的 loop 可有效地 形成稳定的 hpRNA 朱俊华等 2004 当 stem 长度为 300nt 时 载体的构建相当困难 从目前的 研究结果看 较适宜的茎环比例应为 3 1 4 1 温孚江 2004 国家基金 适宜茎长度和茎环比例的 确定为研究中构建 dsRNA 的高效表达载体提供了依据 高效启动子的选用可能也是高效诱发 RNAi 的另一重要因素 Que 等 1997 研究发现由强启动 子驱动的 chs 转基因引起的 PTGS 比用弱启动子驱动转基因要有效的多 Waterhouse 等 1998 用 35S 启动子驱动残缺的部分基因被排列成发夹 RNA hairpin RNA 转录物的反向重复 uidA 转基因 结果获得很高的沉默发生率 90 而用不带启动子的反向重复结构基因沉默则明显地减少 推测 高强度的转录可能较低强度的转录更易于产生 dsRNA 说明转录产物产生的速率对于激发 PTGS 是 非常重要的 玉米乙醇脱氢酶基因启动子 ubi 具有高效启动转录的作用 并且它基本不受组织细胞的限制 是禾本科植物中较为常见的启动子 能够有效地提高外源基因在水稻愈伤中的瞬间表达 效率为35S 启动子的4倍 Pnzip 启动子是一种具有严格组织专一性的启动子 它能驱动外源基因在光合组织中 特异 高效表达 效率为35S启动子的9倍 在RNA介导的植物病毒抗性研究中 目前尚未见有关比 较不同类型启动子抗病性的系统报道 本研究将在这方面进行深入 系统地探讨 主要参考文献 主要参考文献 1 Boogaart TV et al Replicase derived resistance against Pea early browning virus in Nicotiana benthaminaa is an unstable resistance based upon posttranscriptional gene silencing MPMI 2001 14 2 196 203 2 Boutla A et al Short 5 phosphorylated double stranded RNAs induce RNAinterference in Drosophila Cuurr Biol 2001 11 1776 1780 3 Cogoni C Macino G Posttranscriptional gene silencing in Neurospora by a RecQ DNA helicase Science 1999 286 2342 2344 4 Cogoni C et al Suppression of gene expression by homologous transgenes Antonie Van Leeuwenhoek 1994 65 3 205 209 5 Derek M et al Silencing viral infection PLoS Medicine 2006 3 7 1000 1004 6 Dougherty W G et al Transgenes and gene suppression Telling us something new Curr Opin Cell Biol 1995 7 399 405 7 Einav Y et al shRNA mediated RNA interference as a tool for genetic synthetic lethality screening in mouse embryo fibroblasts FEBS Lett 2005 579 1 199 202 8 Elbashir S M et al RNA interference is mediated by 21 and 22 nucleotide RNAs J Genes Dev 2001 15 188 200 9 Fire A et al Potent and spacific genetic interferenoe by double stranded RNA in Caenorhabditis elegans Nature 1998 391 806 811 10 Gil J Esteban M 2000 Apoptosis 5 107 114 11 Grishok A et al Genes and mechanisms related to RNA interference regulate expression of the small temporal RNAs that control C elegans developmental timing Cell 2001 106 23 34 12 Herrera Estrella L et al Light induced and chloroplast associated experession of chimearic gene introduced into Nicotiana tabacum using a Ti plasmid vector J Nature 1984 310 115 120 13 Vasil V et al Herbicide resistant fertile transgenic wheat plants obtained by particle bombardment of regenerable callus J Bio Tech 1992 10 667 674 14 Wilson T M A Strategies to protect crop plants against virus pathogen derived resistance blossoms J Proc Natl Acad Sci USA 1993 90 3134 3141 15 Fujimoto H et al Insect resistant rice generated by the introduction of a modifide endotoxin gene of Bacillus thuringiensis J Bio Tech 1993 11 1151 1155 16 Oeller P W et al Reversible inhibition of tomato fruit senescence by antisense RNA J Sciece 1991 254 437 439 17 Mariani C et al Induction of male sterility in plants by a chimaeric ribonuclease gene J Nature 1990 347 737 741 18 Gasser C S Fraley R T Genetically engineering plants for crop impovement J Science 1989 244 1293 1299 19 Van der Salm T et al Insect resistance of transgenic plants that express modified Bacillus thuringiensis cryIA b and cryIC genes a resistande management strategy J Plant Mol Biol 1994 26 51 59 20 白庆荣 等 利用 RNA 介导的抗病性获得抗 2 种病毒的转基因烟草 植物病理学报 2005 35 2 148 154 21 迟胜起 核基质结合区对马铃薯 Y 病毒非翻译 CP 基因及反向重复片段介导的抗病性影响 植物病理学报 2005 35 4 345 351 22 樊龙江 等 转基因植物的基因漂流风险 应用生态学报 2001 4 151 153 23 郭兴启 等 利用 RNA 介导的抗病性获得高度抗马铃薯 Y 病毒的转基因烟草 植物病理学报 2001b 31 4 349 356 24 郭兴启 等 翻译和非翻译马铃薯 Y 病毒外壳蛋白基因介导的抗病性比较 病毒学报 2001a 17 4 360 367 25 赖延东 等 应用定量竞争 RT PCR 筛选芳香烃受体基因 RNA 干扰片段 卫生研究 2006 35 1 7 9 26 李 鹏 等 马铃薯 Y 病毒 CP 基因 5 端和 3 端反向重复结构介导的抗病性研究 植物病 理学报 2007 37 1 69 76 27 李建龙 等 SiRNA 活性与 mRNA 二级结构关系的研究 生物医学工程研究 2006 25 1 46 52 28 刘晓玲 等 PVX 25kD 运动蛋白基因和外壳蛋白基因介导的抗病性研究 作物学报 2005 31 7 827 832 29 温孚江 等 转录后基因沉没与植物的病毒抗性 生物工程学报 2001 17 3 213 235 30 羊正纲 等 载体法筛选乙型肝炎病毒 S 基因小干扰 RNA 靶位体系的建立 中华肝脏病杂 志 2004 12 9 515 518 31 赵明敏 等 瞬时表达靶向 TMV 外壳蛋白基因的 siRNA 能干扰病毒侵染 植物病理学报 2006 36 1 35 40 32 赵远 RNA 干扰治疗马凡综合症的载体和靶位点基础 博士论文 2003 年 33 朱常香 等 RNA 介导的病毒抗性在转基因烟草中的遗传 遗传学报 2005 32 1 94 103 34 朱俊华 等 马铃薯 Y 病毒衣壳蛋白基因片段长度对 RNA 介导抗病性的影响 中国科学 C 辑 2004b 34 1 23 30 35 朱俊华 等 正向和反向重复 RNA 介导的抗马铃薯 Y 病毒基因工程比较研究 植物病理学报 2004a 34 2 133 140 36 竺晓平 等 马铃薯 Y 病毒 CP 基因的短片段及其反向重复转基因烟草的 RNA 介导的抗病性 研究 中国农业科学 2006 39 6 1153 1158 杨予涛 等 一个光合组织特异表达强启动子的分离及功能分析 中国科学 C 辑 2003 8 33 4 228 306 三 研究方案 主要研究内容 研究方法和技术路线 本研究以马铃薯 Y 病毒外壳蛋白基因 3 端 400bp 的序列为靶目标设计反向重复序列 插入含有 三种不同启动子的表达载体 PCAMBIA1300 中 构建 hpRNA 结构的植物表达载体 转化烟草 进行抗病 性鉴定 分析不同启动子对 RNA 介导的病毒抗性的影响 寻找能够引发 RNA 介导病毒抗性产生的最佳 类型的启动子 同时探讨启动子对 RNA 介导病毒抗性的作用本质 研究方法研究方法 1 不含内含子的反向重复序列的表达载体的构建 hpRNA 的构建如图所示 转录 400bp 100bp 2 含有内含子的反向重复序列的表达载体的构建 hpRNA 的构建如图所示 载体的构建以双元载体 pCAMBIA1300 为基础 设计引物 两端加上适宜的限制性内切酶位点 PCR 分别扩增花椰菜花叶病毒 35S CaMV35S 启动子 水稻肌动蛋白基因 Act1 启动子 玉米乙醇脱 氢酶基因 Ubi 启动子和 PNZIP 基因启动子和胭脂碱合成酶基因 3 端 Nos 终止子 将扩增的启动子和 终止子连接于双元载体 pCAMBIA1300 中 获得含有不同启动子的重组的表达载体 以已克隆的 PVY 的 CP 基因 3 段 400bp 的 cDNA 区段为目的基因 分别反向重复插入含有不同启 动子植物表达载体 pCAMBIA1300 中 在SacI 位点和 EcoRI 位点之间插入 Nos 3 终止子 在 XhoI 单位点插入 NptIII 抗性基因 在 HindIII 和 BamHI 位点之间插入三种不同类型的启动子 不含有内含子的载体以 CP 基因为模板 设 计引物扩增出 400bp 目的片段 并插