内毒素知识介绍

内毒素知识介绍 2010 01 16 10 00 17 转载 标签 抗体 细胞因子 蛋白 酶 试剂盒 信号转导 凋亡 生化 试剂 干细胞 生物 ips 分类 精彩推荐展示 细菌内毒素 英文称作 Enolotoxin 是 G 菌细胞壁个层上的特有结构 内毒素为外源性致热原 它 可激活中性粒细胞等 使之释放出一种内源性热原质 作用于体温调节中枢引起发热 内毒素的主要化学 成分为脂多糖中的类脂 A 细菌内毒素这个概念在 1890 年的时候就已被提了出来 它是在研究发热物质过程所引成的 1933 年 Boivin 最先由小鼠伤寒杆菌提取出来 进行化学免疫学方面的研究 到 1940 年时候 Morgan 使用志贺氏 痢疾菌阐明了细菌内毒素是由多糖脂质及蛋白质三部分所组成的复合体 到了 1950 年以后 随着生物学 物理化学 免疫学以及遗传学等的进步发展 细菌内毒素的研究工作 尤其是其化学结构组成及各种生物 活性间的关系也更加明确起来 细菌英文叫 Bacteria 为原核生物中的一类单细胞微生物由二分裂法繁殖 若按革兰氏染色法可将 细菌分为 G 菌和 G 菌两大类 这两类细菌细胞壁的结构和化学组成存在很大差异 唯有肽聚糖为其共同 成分 但其含量的多少和肽链的性质有所不同 见下表 细胞壁结构革蓝氏阳性菌革蓝氏阴性菌 厚度厚 15 50薄 10 15 肽聚糖含量多 占胞壁干重 50 80 少 占胞壁干重 10 左右 脂类含量少 约 1 4 多 约 11 22 磷壁酸有无 外膜无有 脂蛋白无有 脂多糖无有 关于细菌细胞壁结构 尤其 G G 菌不同之处见下图所示 由以上结构模式图可以发现 G 菌与 G 菌有不同之处 其中对于 G 菌来说 细胞壁较薄 厚约 10 15nm 结构也较复杂 肽聚糖含量低 仅占细胞干生 10 左右 层薄又较疏松 因肽聚糖之间仅四肽侧链直接联结 缺乏五肽桥 肽聚糖居于细胞最内层 外面由内向外还有脂蛋白 外 膜和脂多糖的三层聚合物 1 脂蛋白 lipoprotein 由类脂和蛋白质构成 联结在外膜与肽聚糖层之间 类脂一端经非共价键 联结到外膜的磷脂上 另一端由共价键联结到肽聚糖肽链中的二氧基庚二酸 残基上 使外膜和肽聚糖层 构成一个整体 2 外膜 outer membrane 是革兰氏阴性菌细胞壁的重要结构 位于肽聚糖的外侧 其结构类似细 胞膜 为液态的磷脂双层 其中镶嵌一些特异蛋白质 穿透外膜的内外双层 呈液态镶嵌体 外膜中间有 微小孔道 容许水溶性的小分子通过 以进行细胞内外的物质运输和交换 除此之外 外膜还能防止胰蛋 白酶和溶菌酶等进入 起到保护性屏障作用 3 脂多糖 lipopolysaccharide LPS 由多糖 O 抗原 核心多糖和类脂 A lipid A 组成 图 1 8 位于最外层 多糖 O 抗原向外 由若干个低聚糖的重复单 位组成的多糖链 即革兰氏阴性菌的菌体抗原 O 抗原 有特异性 核心多糖由庚糖 半乳糖 2 酮基 3 脱氧辛酸 2 keto 3 deoxyoctonic acid KDO 等组成 所有革兰氏阴性细菌都有此结构 类脂 A 是以脂化的葡萄胺二糖为单位 通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物 具有致热作用 是革兰氏 阴性细菌内毒素的毒性成分 细菌内毒素即 许多病原性细菌所产生的毒素 一般细菌毒素可分为两类 一类为外毒素 Exotoxin 它是一种毒性蛋白质 是细菌在生长过程 中分泌到菌体外的毒性物质 产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌 如白喉杆菌 破伤风杆菌 肉毒杆 菌 金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌 加一类为内毒素 Endotoxin 是革兰氏阴性菌的细胞壁 外壁层上的特有结构 细菌在生活状态时不释放出来 只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时 才表现 其毒性 内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂 A 成分 细菌外毒素与内毒素性质的比较细菌外毒素与内毒素性质的比较 外毒素 外毒素 ExotoxinExotoxin 内毒素 内毒素 ExotoxinExotoxin 几乎无发热性很强的发热性 细菌的代谢产物 细菌外壁层上的特有结构细胞破裂后游 离出来 毒性作用强毒性作用比较弱 很强的免疫原性 制成抗毒素能中和 抗原毒素 抗原性弱 单纯蛋白质 易被分解破坏 核酸多糖的高分子聚合物 不易被分解 破坏 对热不稳定 无透析性耐热性 无透析性 福尔马林可使其转化为类毒素福尔马林不能使毒性消失 对肿瘤细胞几乎无影响破坏肿瘤细胞 白喉毒素 肉毒毒素 破伤风毒素厌 氧菌毒素 溶血性链球菌毒素等 大肠菌 霍乱绿脓菌 沙门氏菌 赤痢 菌等 1 外毒素 exotoxin 有些细菌在其生命活动过程中产生毒素能释放到周围环境中 称为外毒素 产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌 如白喉杆菌 破伤风杆菌 肉毒杆菌 金黄色葡萄球菌以及少数 革兰氏阴性菌 如痢疾杆菌 霍乱弧菌等 细菌外毒素有以下特点 毒性强 如纯化肉毒杆菌外毒素结晶 1mg 可杀死 2 000 万只小白鼠 对人的最小致死量约为 10 4mg 破 伤风毒素对小白鼠的致死量为 10 6mg 白喉毒素对豚鼠的致死量为 10 3mg 对机体组织有选择性的毒性 如白喉杆菌外毒素主要抑制蛋白质合成 特别是影响肽链延长 引发心肌炎 肾上腺出血及神经麻痹等 破伤风外毒素主要毒害脊髓前角运动神经细胞 引起所属肌肉的痉挛强直 具有抗原性 外毒素的化学成分为蛋白质 有抗原性 即以外毒素刺激机体可产生大量的抗毒素 抗毒 素能中和外毒素使其无毒 外毒素用甲醛处理后 脱毒变成类毒素 但仍保持抗原性 2 内毒素 exotoxin 是革兰氏阴性菌的细胞壁成分 细菌在生活状态时不释放出来 只有当细菌 死亡自溶或粘附在其它细胞时 才表现其毒性 内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂 A 成分 内毒素的致病作用无特异性 即各种革兰氏阴性菌对人类引起基本相同的反应 少量内毒素可引起 机体发热反应 大量内毒素进入血液 可使血管透性改变 局部出血 颗粒性白细胞增多或减少和体重下 降 严惩毒时能导致内毒素性休克 内毒素毒性比外毒素小得多 内毒素是外源性致热原 它可能激活中性粒细胞等 使之释放出一种内源性热原质 作用于体温调 节中枢引起发热 细菌内毒素化学结构及化学组份细菌内毒素化学结构及化学组份 到目前为止 我们知道细菌内毒素作为 G 菌细胞壁外表层结构的一部分脂多糖 lipopolysacch aride LPS 主要是由多糖 O 抗原 核心多糖和类脂 A Lipid A 三部分组成 见图所 示 类脂 A 位于最多层 多糖抗原向外由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链 具有特异性 核心多糖分为 内核心及外核心 外核心由数种已糖 包括葡萄糖 半乳糖 乙酰氨基葡萄糖等组成 内核心含有庚糖及 特殊的 KDO 3 脱氧 D 甘露糖 辛酮糖 KDO 以不耐酸的酮糖键与类脂 A 的氨基葡萄糖连接 所有 G 菌 都有此结构 类脂 A 是以脂化的葡萄糖胺二糖为单位 通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物 具 有致热作用 是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分 细菌内毒素生物活性细菌内毒素生物活性 类脂 A 作为内毒素生物活性的主要部分 也是近年来研究报道最多的 由氨基葡萄糖 磷酸 10 18 碳的 长链脂肪酸组成 它与可溶性的 O 特异性链及核心分离后 即有难溶于水的特性 游离后的类脂 A 可自 身凝聚成高分子的复合体 其分子量大小不等 同时它也含有疏水性的中心及亲水性的边沿 是一种双相 分子 又是酸碱两性分子 因此类脂 A 的独特结构使细菌内毒素具有多种的生物活性 细菌内毒素不同水平上的生物活性细菌内毒素不同水平上的生物活性 A 机体水平 发热性 致死毒性 体重减少 Shwartzman 反应 骨髓反应 bone marrow reaction 白血球减少 lEUcopenia 血小板减少 thrombocytopenia 非特异的感染防御 nonspecific resitance 耐受性 tolerant 辅药作用 adjuvant 寒颤 血压低下 血管内 凝固 B 细胞水平 巨噬细胞的活性化 TNF IL 1 IL 6 产生 阻止巨噬细胞游走 淋巴球 olony formation stimulation 前列腺素的产生 抗肿瘤坏死作用 C 分子水平 补体活化性 Hageman 因子活化性 纤维蛋白溶酶原活性化 鲎细胞溶解物凝集 细菌内毒素的耐热性细菌内毒素的耐热性 我们知道细菌内毒素除了具有各种生物活性外 还具很强的耐热性 一般的高压灭菌不能使其灭活 需 250 30 分钟以上的干热灭菌才能使其灭活 目前我国药典热原检查法和细菌内毒素检查法中关于玻璃用 具的灭菌处理为 180 2 小时或 250 30 分钟以上 而日本药局方第十三改正为 250 1 小时以上 其它各 国药典也大都如此 据国外文献报导 当对细菌内毒素的稀水溶液 在不同温度下保温处理后进行检测 发现其内毒素活性在 200 1 小时时还能检测出来 而只有当加热到 250 1 小时才能完全灭活 国内细菌 内毒素标准品的耐热情况虽然未能考察 但可以认为对细菌内毒素检查法中玻璃用具等的除菌最好采用 250 1 小时以上的干烤处理 细菌内毒素的除去方法细菌内毒素的除去方法 由于细菌内毒素具有很强的耐热性 因此对于它的去除采用一般的灭菌方法是无法达到的 尤其是 制药行业注射剂中内毒素的除去 对于临床用药的安全性意义重大 因此对于药品中内毒素去除可以使用 过滤及高压灭菌方法 而对于一般水溶液 则普通采用薄膜过滤后高压法 对于实验中所用器具可使用干 热或射线给予灭活 其它也可使用酸 碱破坏的方法 对于细菌内毒素检查法中所用实验用具的外源性内 毒素除去方法 最好采用 250 2hr 以上的干热灭菌方法 各种外界因素对细菌内毒素活性的影响各种外界因素对细菌内毒素活性的影响 细菌内毒素的生物活性随外界因素的影响变化很大 目前已经知道 一些金属离子 超声波以及温 度等都会对细菌内毒素的生物活性产生很大影响 据国外文献报导 铁离子 铝离子和镓离子等会引起细 菌内毒素活性的降低 因此在试验过程中最好使用玻璃用具 以必免这些因素 另外温度的高低对细菌内 毒素水溶液活性影响很大 根据国内外文献的报道 内毒素水溶液活性随着环境温度的升高而降低 因此 对于内毒素水溶液一定要在低温处保存 而且对已经稀释好的内毒素水溶液 要尽可能的在 2 小时内用完 以免活性降低 细菌内毒素致病机理细菌内毒素致病机理 1 致热性 内毒素可使人体和动物致热 人体对内毒素致热原敏感 在正常情况下 人体内内毒素的正常阈值保 持在 0 001 0 05ng ml 之间 一旦人体免疫力下降或遭受某种致病菌侵袭时 细菌便在机体内繁殖崩解 释放出大量的内毒素 当体内内毒素的浓度高于这个阈值时 即可启动内外源致热原引起机体发热 2 内毒素对糖代谢的影响及其机理 内毒素直接或间接损害肝脏 引起糖代谢紊乱及酶学 蛋白代谢的改变 致病机理 脂多糖能刺激肾上腺素的分泌和释放 使磷酸环化酶活性增强 加速糖分解 使血糖浓度表 现为暂时性升高 低血糖症的主要机理 脂多糖进入机体数小时后 始作用于肝细胞 引起肝细胞的损伤 使糖元异生的 关键酶活性降低 抑制糖原的异生和分解 激活丙酮酸激酶 加速葡萄糖的分解氧化 并产生大量的热量 在临床上表现为发烧症或持续低血糖症 内毒素致肝脏枯否氏细胞功能受到抑制 进而影响对内毒素的消 除及对胰岛素的分解代谢 3 内毒素对血液循环系统的影响及机理 内毒素可引起白细胞和血小板减少 激活凝血 纤溶系统 产生出血倾向 可导致弥漫性血管内凝血 DIC 的发生 DIC 严重时 可导致严重的休克症状 内毒素 脂多糖 对中性粒细胞的作用及机理 内毒素 脂多糖 能引起人体血液中中性粒细胞的增多 这是人体对内毒素反应最敏感的指标之一 亚致热量即可引起中性粒细胞的减少 并伴之以粘连性增加 数小时后 中性粒细胞明显增多 脂多糖对血小板的影响 对实验动物注射足量的脂多糖后 均能导致动物血液中血小板明显减少 脂多糖对淋巴细胞的作用 脂多糖作用于 B 淋巴细胞 可增强 B 淋巴细胞 DNA 的合成 脂多糖能提高人 体体液免疫功能 革兰氏阴性菌感染后引发的机体发热是人体自我防御功能的表现 是积极的 脂多糖对单核细胞和巨噬细胞的作用 增强吞噬和巨噬细胞的杀菌能力 同时 脂多糖作用于巨噬细胞 和单核细胞后 能产生多种中介物质 参与外源性凝血过程 脂多糖能刺激单核细胞和巨噬细胞产生集落 刺激因子 GSF 对红细胞和血清铁的影响 脂多糖能抑制红细胞的生成 脂多糖直接作用于骨髓造血干细胞 抑制骨髓 的造血功能 内毒素可导致血清铁浓度的降低 内毒素血症的另一病症就是缺铁性贫血 内毒素可经 C3 旁路或经典途径激活补体系统 最终导致血压下降和血液动力学的改变 出现局部或全 身性 shwartzman 炎症症状 并伴有轻微的发热症状 细菌内毒素作用机理细菌内毒素作用机理 1 3 D glucan 1 3 D glucan 概念 结构及活性概念 结构及活性 1 1 3 D glucan 概念 1 3 D glucan 在自然界的分布很广 主要存在于担子菌 真菌 地衣类 高等植物以及酵母 藻类的菌体成分中 平均分子量在 6800 左右 分子结构具用多样性 另外 某些使用人造纤维制作的人 工肾透析模上也含有类似物质 但它并不引起家兔的升温过程 关于 1 3 D glucan 旁反应系是否可 以单独形成凝固蛋白 或是与 ET 反应系的共同作用形成凝固蛋白 目前国外学者尚有一定分歧 1 3 D glucan 对热极为稳定 高压 121 1 小时不以使其全部灭活 需 250 2 小时干热灭菌处理才能彻底 去除 另外强酸 强碱以及一些酶类也能使其灭活 目前在日本 尤其是在药局方的各种解说书中 无热 原的概念即灭菌后的用具除了无 ET 外 还要求无 1 3 D glucan 这一点要引起足够重视 2 1 3 D glucan 结构 由上可知 1 3 D glucan 在自然界的分布很广 可以说明它同细菌内毒素一样 无处不在 无 处不有 有关它的化学结构如下所示 除此之外 它还有许多其它高一级的结构 如 1 4 D glucan 1 6 D glucan 结构等 3 1 3 D glucan 生物活性 1 3 D glucan 与细菌内毒素一样 除了结构的多样化外 它们也有许多共同特性 如对热的稳 定性 不易去除 不同菌株所产生的结构差异性等 作为 1 3 D glucan 的生物活性主要表现在以下 几个方面 1 3 D glucan 类的生物活性 1 刺激机体的 MQ 巨噬细胞产生各种细胞分裂素 Cytikines TNF IL 1 IL 6 等 2 激活补体第二条经路 3 抗肿瘤作用 4 抗炎症作用 5 抗放射线作用 6 激活 G 因子旁路使鲎血细胞裂解液 LAL TAL 试剂 产生凝集反应 细菌内毒素标准品细菌内毒素标准品 作为内毒素的研究和使用者对于高纯度的内毒素标准品的渴望是十分迫切的 我们知道 细菌内毒 素的活性随着菌株来源不同 调制方法及分散状态等不同差异很大 因此作为一个好的标准内毒素必须有 满足以下条件 1 菌株来源要有很好的稳定性 2 能够很好地确定其化学分析值 3 强的发热性与鲎试验活性间要有很好的相关性 4 反应曲线为直线型 5 易溶 在冻冷状态下能长时间稳定贮存 6 高纯度并能保证供应 WHO 在 1950 年开始就提出了热原标准品的问题 在 1959 年 Shigella dysenteriae 内毒素第一次作为 WHO standard 被采用由于这个标准品稳定性等问题 目前已不在使用 之后 随着内毒素的研究 尤其 是鲎试验法的研究与应用 各种新的内毒素标准品已被制备出来 目送各国在内毒素标准品菌株的选择上 一般均使用发热活性比较强的大肠杆菌 除添加附形剂稍有不同处 其对家兔的性几乎都是一样的 各种 内毒素标准品 除了发热性好外 还要求具有鲎试验活性 化学分析值安定性 均一等 目前 WHO 最新的 细菌内毒素标准品为 EC 6 以下为三国标准内毒素化学分析值 供参考 Referenceendotox in JapanE coliUK TB USAE colio11 3 GermanyS abortusequ i Hesose24 9 23 56 66 2 Heptose9 32 385 0 Heptosamine7 916 44 2 KDO4 53 886 8 FattyAcid20 835 010 7 C12 02 62 2 C14 01 91 8 C16 0trace1 1 3 oH c14 015 95 6 Phosphate8 854 275 0 N1 82 584 amino Larabinose0 3 Protein 1Ethanoloamine0 2 Nucleicid 12 58Na1 8 细菌内毒素工作标准品 主要用于日常检验工作和实验研究 尤其在内毒素检查法中 用于阳性对 照和样品的阳性对照 其力价要比参考内毒素标准品要低的多 由于制备工艺不同其对鲎试剂的反应性也 存在很大差异 因此在实验中 为了保证实验有效和准确建立稳定统一的 CSE 是十分必要的 另外 目前的内毒素标准品一般都是针对凝胶法而言的 虽说国外在定量法使用上已逐渐增多 但真正的 定量法专用内毒素标准品还没有 因此定量法中使用的内毒素标准品的研究是十分重要的 细菌内毒素量值细菌内毒素量值 关于细菌内毒素的量值在 80 年代几乎都是以重量单位来表示它很不科学 相同重量的内毒素 由于 菌株来源不同 提取方法各异而且所加附形剂不同 因此其生物活性相差很大 如 EC 2 和 EC 5 其重量 换算单位分别 5EU ng 和 10EU ng 因此随着人们对内毒素生物活性的不断提高 以效价单位表示内毒 素的量值是十分合理的 目前 世界各国药典所收载的细菌内毒素标准品均是以效价单位来表示 由于各国所用菌种来源不 同 加入的赋形剂不同 其效价也不尽相同 如美国药典内毒素参考标准品 EC 6 的效价为 10000EU 瓶 JP 为 16000EU 瓶 BP WHO 为 14000EU 瓶 而中国药典内毒素参考标准品 Lot 981 的效价为 9000EU Amp 因此 建立统一的细菌标准品是目前各国所面临的一大问题 内毒素血症内毒素血症 内毒素血症是由于血中细菌或病灶内细菌释放出大量内毒素至血液 或输入大量内毒素污染的液体而 引起 内毒素血症分为内源性和外源性两大类 1 内毒素血症发生的原因 在严重创伤 感染等应激状态下可出现 全身网状内皮系统功能障碍 免疫机能下降 肠道吸收的内毒素过多而超过机体清除能力 胃肠道粘膜缺血 坏死 屏障破坏 大量内毒素释放入血 肠道吸收的内毒素因肝功能障碍由侧枝循环直接入体循环 某些组织 器官的感染引起外源性内毒素入血 2 内毒素血症的临床症状 内毒素血症临床症状主要决定于宿主对内毒素的抵抗力 症状和体征有 发热 白细胞数变化 出血 倾向 心力衰竭 肾功能减退 肝脏损伤 神经系统症状 以及休克等 内毒素可引起组胺 5 羟色胺 前列腺素 激肽等的释放 导致微循环扩张 静脉回流血量减少 血压下降 组织灌流不足 缺氧及酸中 毒等 3 内毒素血症的后果 内毒素血症可以出现在多系统的多种疾病中 通常导致致死性感染性休克 多器官功能衰竭 弥漫性 血管内凝血等 病死率极高 内毒素血症可引起一系列病理生理改变 发热反应 内毒素直接作用于下丘脑体温调节中枢 或作 用于白细胞使之释放内原性致热原 促使血管活性物质如缓激肽 组胺 5 羟色胺 血管紧张素等释放 使血压下降 导致微循环障碍 引起白细胞和血小板减少 激活凝血 纤溶系统 产生出血倾向 弥漫 性血管内凝血 经 C3 旁路或经典途径激活补体 直接或间接损害肝脏 引起糖代谢紊乱及酶学 蛋 白代谢的改变 激活白三烯 前列腺素 巨噬细胞 单核细胞及内皮细胞活性 4 各类疾病内毒素血症的发生率 急性肝炎 37 64 爆发性肝炎 58 100 丙肝 61 54 胆石症伴急性梗阻性化脓性感染 85 烧伤 85 败血症 70 多器官功能衰竭 100 急性胰腺炎 90 皮肤软组织感染 70 81 1 腹腔感染 72 84 尿路感染 70 80 肾炎 癌症 70 肺炎 100 上感 100 5 内毒素血症的治疗 内毒素血症的治疗原则多主张 减少内毒素的产生和吸收 改善内毒素引起的微循环障碍 肠源性内毒素血症 许多非革兰氏阴性菌感染的重症病人及处于应激状态的患者 绝大部分出现内毒素血症 血浆中内毒 素血症主要来源于肠道内毒素的吸收 因此肠源性内毒素血症是病人死亡的主要原因 肠源性内毒素血症的发病机制与如下几方面有关 1 肠道内毒素生成和摄取增多 肠道微生物移位 机体免疫功能受损和肠粘膜免疫屏障的破坏 内毒素移位 进入血循环 肠粘膜屏障功能障碍 粘膜缺血 萎缩 破损 脱落均可造成内毒素移位 发生肠源性内毒素血症 肠道微生态环境破坏 广谱抗生素的长期应用减少了对抗生素敏感的厌氧菌的数量 导致革兰氏阴性菌大 量繁殖 突破粘膜屏障而移位进入血循环 2 肝脏对内毒素的清除功能减退 大量内毒素在肝脏未经解毒溢入体循环 3 门体系统功能障碍 出现门体分流 来自肠道的内毒素绕过肝脏 未经灭活解毒 涌入体循环 形 成内毒素血症 4 淋巴液生成增加 腹腔淋巴管 胸导管是内毒素进入体循环的重要替代途径 5 外周血内毒素灭活功能