BPG-层析柱标准装柱流程规范

BPG300 层析柱标准装柱流程规范 SOP BPG 001 1 操操 作作 标标 准准 目的 为了使 BPG300 层析柱装柱过程可重复 并能够得到较好的柱效 故建立此 操作规范 范围 配合 KTA process 系统进行有效的蛋白质纯化操作 责任人 层析工序操作人员 标准操作程序 1 基本术语概念基本术语概念 填料因子 填料因子 Packing Factor PF 指在在装柱过程中 用低流速 如 60cm h 对填料进行沉降压缩得到的调料高度和最后装柱完成时填料高度 柱 高 的比值 GEHC 生产的各种常见填料的 PF 参见 GEHC AxiChrom 300 1000 columns User Manual 28 9562 89 Edition AA 线性流速 线性流速 linear flow rate 单位时间内液体流经的直线距离 常用 cm h 表 示 体积流速 体积流速 volume flow rate 单位时间内液体流经的空间容积 常用 ml min 表示 BPG300 层析柱标准装柱流程规范 SOP BPG 001 2 换算 换算 2 准备工作准备工作 2 1 检查层析柱的完整性 所带配件 是否水平 用水平仪矫正 是否清洁 如有污染应进行清洗 2 2 确定所用填料及其特性 浓度等 以 DEAE Sepharose Fast Flow 填料为例 其填料因子 PF 为 1 15 新填料 slurry 浓度为 75 保存于 20 乙醇中 耐压 3bar 2 3 确定放大后的工艺参数 以 XX 生化制药股份有限公司的放大工艺为例 中试工艺参数 柱高 h 10cm 体积流速 v1 3ml min 柱内径 d 1 6cm 即 线性流速 v2 v1 s 柱 3 3 14 0 82 cm min 1 5 cm min 样品与填料接触时间 t h v2 10 1 5min 6 67min 在工艺的线性放大中 h v2 和 t 均不变 则可保证样品出峰的位置 洗脱时间 和形 状不变 使用 BPG300 层析柱进行放大的工艺参数 装柱体积 V柱 S柱h 3 14 1 52 1L 7L 装柱需要 slurry 体积 Vslurry V柱 PF Cslurry 以 DEAE Sepharose Fast Flow 为填料 则 Vslurry 7 1 15 0 75L 10 73L 装入柱中的 slurry 高度 Lslurry Vslurry S柱 10 73 3 14 1 52 dm 1 52dm 15 2cm 3 管路安装管路安装 3 1 层析柱管道和配件安装 3 1 1 卸下柱子顶部和底部的盲堵垫圈 旋松密封调节器 用纯水或 20 乙醇 充分浸润柱内壁和柱头 O 型圈 3 1 2 用扳手对称卸下支持杆连接到法兰的螺丝 并通过旋转高度调节手柄将柱 头旋至最高处 在柱头顶部依次安装压力表和四路二通阀 在柱底安装四路二 BPG300 层析柱标准装柱流程规范 SOP BPG 001 3 通阀 3 1 3 在顶部四路二通阀上横向连接一根细管 另一端连至 KTA process 上端 连接口 COLUMN TOP 同时从柱底四路二通阀横向接出一根细管至 KTA process 的下端连接口 COLUMN BOTTOM 图图 1 BPG300 层析柱安装示意图 3 2 层析柱下端筛网排气泡 3 2 1 连接两根足够长的细管到 KTA process 进样泵的 A1 和 B1 进口 两管另 一端均放入纯水中 3 2 2 从 A1 泵入纯水 打开 UNICORN 软件 在 system control 窗口点击 manual valves InletA 选择 inletA1 insert InletB 选择 BPG300 层析柱标准装柱流程规范 SOP BPG 001 4 closed insert Column 选择 upflow insert Pump Flow 设定流速 60L h 点击 execute 运行程序充水至 BPG 柱中 2 3cm 左右 pause 清除下端 筛网中的空气 用注射器吸出筛网中残留的气泡 4 装填料装填料 4 1 准备填料 所用填料为 DEAE Sepharose Fast Flow 装置的是保存于 20 乙醇中的新 slurry 4 2 卸下柱头 用搅拌棍引流加入混匀的 slurry 至 15 2cm 处 再加入纯水至 40cm 左右 充分搅拌混匀 同时避免挤压筛网和柱壁 静置使填料界面至少 低于 38cm 4 3 在 system control 窗口点击 manual valves InletA 选择 inletA1 insert InletB 选择 closed insert Column 选择 downflow insert Pump Flow 设定流速 60L h 点击 execute 运行程序将柱 头上端筛网充满水以除去气泡 再装上柱头 用密封调节器固定柱头 拧紧螺 丝 4 4 在 system control 窗口点击 manual Pump Flow 设定流速为 42L h 60cm h 进行填料的沉降 待填料高度降至 14cm 左右 将密封调节 器旋至全松 将柱头快速调至距离填料 3 4cm 处 将密封调节器旋至半松 将 柱头快速调至滤网距离填料 1 2cm 旋紧密封调节器 再设定高流速 如 150L h 继续压缩填料 最后再调节柱头至 10cm 整个过程一直有流速 泵 速不能停 5 柱效测定柱效测定 BPG300 层析柱标准装柱流程规范 SOP BPG 001 5 图图 2 柱效测定示意图 5 1 平衡 将 A1 接口细管放入 0 4M NaCl 溶液中 将柱顶端四路二通阀调至管路与大 气相连状态 在 system control 窗口点击 manual valves InletA 选择 inletA1 insert InletB 选择 closed insert Column 选择 downflow insert Pump Flow 再设定高流速 如 150L h 点击 execute 运 行 排气泡 再将阀调至管路与柱头相连状态 平衡 3 5 个柱体积至电导曲线 稳定 点击 END 5 2 上样 5 2 1 将 B1 接口细管放入 2M NaCl 溶液 柱顶端四路二通阀调至管路与大气相 连状态 在 system control 窗口点击 manual valves InletA 选择 Closed insert InletB 选择 InletB1 insert Column 选择 downflow insert Pump Flow 设定高流速 150L h 点击 execute 运行 排 气泡 pause BPG300 层析柱标准装柱流程规范 SOP BPG 001 6 5 2 2 在 system control 窗口点击 manual Other End Timer 选择 Acc Volumn Timeout 设上样量为 70mL 1 柱体积 Pump Flow 设定上样流速 60L h 点击 execute 的同时将柱顶端四路二通阀调至管路与柱头相连 完成 上样 5 3 洗脱 5 3 1 将柱顶端四路二通阀调至管路与大气相连状态 在 system control 窗口点 击 manual valves InletA 选择 inletA1 insert InletB 选择 closed insert Column 选择 downflow insert Pump Flow 设定高流速 150L h 点击 execute 运行 排气泡 同时将管路充满 0 4M NaCl 溶液 调 流速至 21L h 30cm h 5 3 2 待流速稳定后 在 system control 窗口点击 manual valves Injection Mark insert 点击 execute 的同时将柱顶端四路二通阀调至管路与柱头相连 开始洗脱 在一个柱体积左右 电导检测下将产生目的峰 5 4 测柱效 在 Evaluation 窗口中 选择实验保存的结果 在结果图中点击鼠标右键 选 择 Properties 点击 Clear 并选中 Cond 102 点击 OK 回到 Evaluation 窗口 BPG300 层析柱标准装柱流程规范 SOP BPG 001 7 选择积分按钮 在弹出窗口中 选择 Cond 102 peak window 中调整积分的范 围 并在 Reject Peaks 中 填 Peak must be one of 1 largest 确定后 在积分结 果窗口 点击右键 选择 Properties 在 peak table 选项中 勾选 Plate Height HETP 和 Asymmetry 确定后即可计算得到计算理论塔板高度 HETP 和对称因子 As BPG300 层析柱标准装柱流程规范 SOP BPG 001 8 1 When calculati