DB32T 3762.2-2020 新型冠状病毒检测技术规范 第2部分：病毒分离与鉴定

ICS11.020C 62DB32江苏省地方标准DB 32/T 3762.22020新型冠状病毒检测技术规范第2部分：病毒分离与鉴定Technical specifications for SARS-CoV-2 detectionPart 2: Virus isolation and identification2020 - 03 - 02发布2020 - 03 - 03实施江苏省市场监督管理局发布DB32/T 3762.22020前言DB32/T 3762新型冠状病毒检测技术规范目前分为以下部分：第1部分：生物样本采集、运输和保存；第2部分：病毒分离与鉴定； 第3部分：核酸荧光PCR检测程序；第4部分：重组酶介导等温扩增程序；第5部分：血清IgM和IgG抗体酶联免疫吸附检测程序；第6部分：血清IgM和IgG抗体胶体金免疫层析检测程序；第7部分：空气样本检测与评估；第8部分：物体表面检测与评估；第9部分：医务人员职业暴露检测与评估。本部分为DB32/T 3762 的第2部分。本部分按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本部分由江苏省卫生健康委员会提出。本部分由江苏省卫生标准化技术委员会归口。本部分起草单位：江苏省疾病预防控制中心、南京医科大学、苏州第五人民医院、苏州大学附二院、昆山市疾病预防控制中心。本部分主要起草人：迟莹、朱宝立、葛以跃、郭喜玲、崔仑标、程军平、徐佳南、钱志远、罗晓明、沈欢喜。3新型冠状病毒检测技术规范 第2部分：病毒分离与鉴定1 范围本部分规定了新型冠状病毒感染临床样本病毒分离培养环境与设施、设备与耗材、试剂与材料、操作步骤和清场与消毒。本部分适用于新型冠状病毒感染患者各类临床样本中新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的分离培养，其它呼吸道病毒的分离培养程序可参照执行。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。新型冠状病毒实验室生物安全指南 中华人民共和国国家卫生健康委员会3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件 3.1细胞病变效应 cytopathic effect，CPE病毒在宿主细胞内大量增殖，导致细胞病变甚至死亡的现象。大多数病毒感染敏感细胞培养都能引起其显微表现改变，如细胞聚集成团肿大圆缩脱落及细胞融合成为多核细胞，细胞内出现包涵体，乃至细胞裂解等即细胞病变效应。 4 环境与设施4.1 实验室资质及级别要求：应符合新型冠状病毒实验室生物安全指南的要求，实验室开展新型冠状病毒感染临床样本病毒分离培养相关活动前，应报经国家卫生健康委批准，取得开展相应活动的资质，并需在生物安全三级（BSL-3）实验室进行。4.2 操作人员资质及防护要求：实验操作人员应经过生物安全培训并取得BSL-3实验活动上岗证，在身体健康状态良好的情况下准入。操作人员按BSL-3级实验室个人防护的要求进行防护，需配备N95及以上级别防护口罩、护目镜或防护面屏、连体防护服、一次性手术衣、一次性PE手套、乳胶手套、 鞋套、靴套等防护装备。5 设备与耗材5.1 设备生物安全柜、离心机、倒置显微镜、涡旋器、CO2培养箱等。5.2 耗材一次性平皿、剪刀、镊子、聚四氟乙烯研磨器（塑料）、离心管、细胞培养瓶/细胞管、移液器、移液管、带滤芯Tip头等。6 试剂与材料6.1 临床样本6.1.1 呼吸道样本：咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等。6.1.2 尸体解剖组织样本。6.1.3 血液样本：病人急性期血清。6.2 试剂6.2.1 Hanks溶液（每毫升含青、链霉素各2000单位）。6.2.2 DMEM培养液（含10%胎牛血清）。6.2.3 DMEM维持液（含2%胎牛血清）。6.2.4 消化液 （0.25%胰酶和0.025% EDTA-Na2 混合液）。6.3 细胞非洲绿猴肾传代细胞（VERO-E6）、人肝癌细胞（Huh7）等。7 操作步骤7.1 实验前准备7.1.1 将实验所需细胞置37 5% CO2培养箱培养至单层。7.1.2 配备消毒液：75%酒精、0.55%次氯酸钠消毒液。7.1.3 检查BSL-3级实验室压力是否正常。7.1.4 将细胞、样本、试剂和耗材一次性带入BSL-3级实验室核心区。7.2 样本处理7.2.1 呼吸道样本及肛拭子a) 在生物安全柜内涡旋震荡装有呼吸道样本（咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等）及肛拭子的采样管，瞬时离心后取上清液至新的离心管，按终浓度10%20%加入青链霉素，置4冰箱处理样本4-6小时或过夜。b) 将上述处理过的样本4，4000rpm，离心5min，以去除杂质。7.2.2 肺组织样本a) 在生物安全柜内将肺组织放在平皿内，取3 mL5mL的Hanks溶液漂洗3次，以去除组织外部的血垢。漂洗时动作要轻柔，防止气溶胶的产生和液体的溅出。漂洗的废液收集在含0.55%的次氯酸钠消毒液的带盖塑料瓶内。b) 将漂洗后的肺组织，用无菌的剪刀和镊子去除肺组织上的结缔组织和血管，再用Hanks溶液漂洗1次，将肺组织剪成1mm3的小块放在研磨器内进行研磨，研磨的动作要轻柔，注意避免液体的溅出。研磨后制成20%悬液，按终浓度10%20%加入青链霉素，置4冰箱处理样本4-6小时或过夜。c) 将上述处理过的样本管4，4000rpm，离心5min，以去除杂质。7.2.3 血液样本a) 感染急性期血清，按终浓度10%20%加入青链霉素，置4冰箱处理样本46小时或过夜。b) 将上述处理过的样本管4，4000rpm，离心5min，以去除杂质。7.3 接种病毒7.3.1 弃去VERO-E6细胞培养液，用Hanks液洗涤细胞3次，弃上清。7.3.2 吸取50L200L样本液接种至培养孔内，轻轻混匀，置37 5% CO2培养箱，吸附1h2h，期间每15min摇晃一次。7.3.3 吸附后弃上清，补足适量DMEM维持液，置37 5% CO2培养箱培养，设VERO E6细胞对照7.4 细胞病变（CPE）观察与培养物收集鉴定 7.4.1 细胞病变（CPE）观察按上述方法样本接种细胞后，每24h在倒置显微镜下观察细胞形态变化（CPE）：以0%25%细胞CPE变化为“+”，26%50%细胞CPE变化为“+”，51%75%细胞CPE变化为“+”，76%100%细胞CPE变化为“+”，正常细胞形态为“-”。7.4.2 培养物收集每代次收集的培养物需反复冻融三次，4，4000rpm，离心15min，收集上清。7.4.3 培养结果鉴定满足以下两点判定病毒分离成功。若不满足以下条件说明病毒分离不成功，需盲传三代或重新接种临床样本再做鉴定。a) 样本接种孔细胞出现明显CPE(+及以上)；b) 分离培养物进行新型冠状病毒核酸检测呈阳性。8 清场与消毒8.1 操作结束后，及时清理生物安全柜内的物品，用75酒精擦拭外表面后，移出生物安全