土壤中枯草芽孢杆菌的分离和筛选

土壤中枯草芽孢杆菌的分离和筛选 刘倩倩 一 实验目的 1 掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理 熟练掌握无菌接种技术 微 生物分离筛选技术和微生物形态观察技术 2 了解枯草芽孢杆菌的分布 营养 生长等特点 以及它所具有的产淀粉 酶的功能 根据这些特点进行分离和筛选 从而得到纯菌株 二 实验原理 枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌 芽孢 0 6 0 9 1 0 1 5 微米 椭圆到柱 状 位于菌体中央或稍偏 芽孢形成后菌体不膨大 菌落表面粗糙不透明 污 白色或微黄色 在液体培养基中生长时 常形成皱醭 需氧菌 有的菌株是 淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌 有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系 广泛分布在土壤及腐败的有机物中 选择含淀粉丰富的土壤为最佳 80 度的水 浴处理样品 1 小时 目的是杀死微生物营养体 残留芽胞 利用稀释涂布法 在淀粉的培养基培养 培养 1 3 天后 观察 然后 进 行初筛与纯化 利用显微镜进行革兰氏染色 确认是否为枯草芽孢杆菌 再复 筛 测定其淀粉酶活 最后确定菌株 三 实验材料 1 选择培养基 本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选 所以应选淀粉培养基 配方 牛肉膏 5 0g 蛋白胨 10 0g 氯化钠 5 0g 可溶性淀粉 10 0g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml 调整 pH 至 7 2 配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状 再加入到融化 好的培养基中 2 溶液或试剂 牛肉膏 1 25g 蛋白胨 2 5g 氯化钠 1 25g 可溶性淀粉 2 5g 琼脂 5g 碘 11 克 碘原液 2 毫升 碘化钾 42 克 可溶性淀粉 2 克 磷酸氢二钠 45 23 克 柠檬酸 8 068 克 氯化钴 25 克 重铬酸钾 3 34 克 100 毫升 0 01NHCL 3 仪器或其他用品 平板培养皿 10 个 试管 15 支 三角瓶 2 个 烧杯 3 个 称量纸 高压蒸 汽灭菌锅 干燥箱 恒温培养箱 超净工作台 无菌涂布器 电热恒温水浴 500ml 量筒 显微镜 无菌吸管 无菌培养皿 无菌刻度吸管 酒精灯 记号 笔 火柴 试管架 接种钩 滴管等 四 实验步骤 倒平板 制备梯度稀释液 涂布 培养 初筛 复筛 纯化 保存 1 实验前准备 制备淀粉培养基 无菌水 在 121 摄氏度下灭菌 20min 倒平板 把接种 工具 培养基 和其他用品全部在超净工作台上摆好 进行紫外线灭菌 30min 2 制备土壤稀释液 取土样时最好选取如花坛等地方的土样 选好采样地点 产去表层 5cm 去 5 15cm 处 用无菌器具规范采样几十克 装入无菌的塑料袋或纸袋中扎好 记录采样时间 地点 采样环境等以备考证 采样后应尽快分离 振摇约二十 分钟 使土样与水充分混合 将细胞分散 放入盛有 99ml 无菌水三角瓶中 常 压 80 度的水浴处理样品 1 小时后 取出 用一支 1ml 无菌吸管从中吸取 1ml 土壤悬液加入盛有 9ml 无菌水的大试管 中充分混匀 然后用无菌吸管从此试管中吸取 1ml 加入另一盛有 9ml 无菌水的 试管中 混合均匀 以此类推 制成 10 2 10 3 10 4 10 5 不同稀释度的 土壤溶液 3 涂布 将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上 10 3 10 4 10 5 三 种稀释度 然后用无菌吸管分别由 10 3 10 4 10 5 三管土壤稀释液中各吸取 0 2ml 小心地滴在对应平板培养基表面中央位置 用无菌涂布器涂布 右手拿无菌涂布器平放在平板培养基表面上 将菌悬 液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展 使之分布均匀 室温下静置 5 10min 使 菌液浸入培养基 4 培养 将淀粉培养基平板倒置于 30 C 培养箱中培养 1 3d 5 初筛 观察菌落表面粗糙不透明 呈污白色或微黄色 将这样的菌种单个菌落分 别挑取少许细胞接种到培养基上 置于 30 C 的培养箱中培养 若发现有杂菌 需要再一次进行分离纯化 如不能用肉眼更好的观察 可对其进行革兰氏染色 在显微镜下观察 与标准菌种比较 6 复筛 测定其淀粉酶活 1 试剂和器材 1 试剂 碘原液 称取碘 11 克 碘化钾 22 克 加水溶解 稀释至 500 毫升 稀碘液 取碘原液 2 毫升 加碘化钾 20 克 稀释至 500 毫升 此试剂随配随 用 2 淀粉液 称取干燥过的可溶性淀粉 2 克 加 5 毫升蒸馏水 搅拌混和 再 徐徐倾入 70 毫升煮沸的蒸馏水中 继续煮沸 2 分钟 冷却至室温 加入磷酸氢 二钠 柠檬酸缓冲液 PH 为 6 柠檬酸缓冲液 称取磷酸氢二钠 Na2HPO4 12H2O 45 23 克 柠檬酸 C6H8O7 H2O 8 068 克 加水溶解 稀释至 1000 毫升 标准比色液 称取氯化钴 CoCL2 6H2O 25 克和重铬酸钾 3 34 克溶于 100 毫升 0 01N HCL 其五倍稀释作标准 样品 细菌 淀粉酶 2 器材 电热恒温水浴 试管 量筒 吸量管 1ml 3 操作方法 1 取试管 1 支 加 20 毫升 2 淀粉 混匀 在 30 水浴中 使管内温度达到 30 2 将淀粉酶 0 5ml 加到 30 的淀粉液中 混匀 在 30 水浴中保温 自加入记时 经 5 分钟后取反应液 1 毫升 加入盛有 5 毫升稀碘液的试管中 混匀 目测比色 每隔一定时间重复测定 直至呈色与标准比色颜色相同为止 记录反应进行的时间 3 计算 在上述条件下 每一小时催化 1 毫升 2 可溶性淀粉水解的酶量 定为 一个酶活力单位 7 纯化并保存 菌种保存时一般都需要不受杂菌污染 菌种变异很少 并能尽量保持细菌 的形态和生理性状不发生变化 同时 做好以下