全国流感监测技术指南-附件

1 附件 1 20112011 20162016 年周历表年周历表 2011 年年2012 年年 周代码周代码周起始日期周起始日期周终止日期周终止日期周代码周代码周起始日期周起始日期周终止日期周终止日期 110103 01 201109 01 2011120102 01 201208 01 2012 110210 01 201116 01 2011120209 01 201215 01 2012 110317 01 201123 01 2011120316 01 201222 01 2012 110424 01 201130 01 2011120423 01 201229 01 2012 110531 01 201106 02 2011120530 01 201205 02 2012 110607 02 201113 02 2011120606 02 201212 02 2012 110714 02 201120 02 2011120713 02 201219 02 2012 110821 02 201127 02 2011120820 02 201226 02 2012 110928 02 201106 03 2011120927 02 201204 03 2012 111007 03 201113 03 2011121005 03 201211 03 2012 111114 03 201120 03 2011121112 03 201218 03 2012 111221 03 201127 03 2011121219 03 201225 03 2012 111328 03 201103 04 2011121326 03 201201 04 2012 111404 04 201110 04 2011121402 04 201208 04 2012 111511 04 201117 04 2011121509 04 201215 04 2012 111618 04 201124 04 2011121616 04 201222 04 2012 111725 04 201101 05 2011121723 04 201229 04 2012 111802 05 201108 05 2011121830 04 201206 05 2012 111909 05 201115 05 2011121907 05 201213 05 2012 112016 05 201122 05 2011122014 05 201220 05 2012 112123 05 201129 05 2011122121 05 201227 05 2012 112230 05 201105 06 2011122228 05 201203 06 2012 112306 06 201112 06 2011122304 06 201210 06 2012 112413 06 201119 06 2011122411 06 201217 06 2012 2 2011 年年2012 年年 周代码周代码周起始日期周起始日期周终止日期周终止日期周代码周代码周起始日期周起始日期周终止日期周终止日期 112520 06 201126 06 2011122518 06 201224 06 2012 112627 06 201103 07 2011122625 06 201201 07 2012 112704 07 201110 07 2011122702 07 201208 07 2012 112811 07 201117 07 2011122809 07 201215 07 2012 112918 07 201124 07 2011122916 07 201222 07 2012 113025 07 201131 07 2011123023 07 201229 07 2012 113101 08 201107 08 2011123130 07 201205 08 2012 113208 08 201114 08 2011123206 08 201212 08 2012 113315 08 201121 08 2011123313 08 201219 08 2012 113422 08 201128 08 2011123420 08 201226 08 2012 113529 08 201104 09 2011123527 08 201202 09 2012 113605 09 201111 09 2011123603 09 201209 09 2012 113712 09 201118 09 2011123710 09 201216 09 2012 113819 09 201125 09 2011123817 09 201223 09 2012 113926 09 201102 10 2011123924 09 201230 09 2012 114003 10 201109 10 2011124001 10 201207 10 2012 114110 10 201116 10 2011124108 10 201214 10 2012 114217 10 201123 10 2011124215 10 201221 10 2012 114324 10 201130 10 2011124322 10 201228 10 2012 114431 10 201106 11 2011124429 10 201204 11 2012 114507 11 201113 11 2011124505 11 201211 11 2012 114614 11 201120 11 2011124612 11 201218 11 2012 114721 11 201127 11 2011124719 11 201225 11 2012 114828 11 201104 12 2011124826 11 201202 12 2012 114905 12 201111 12 2011124903 12 201209 12 2012 115012 12 201118 12 2011125010 12 201216 12 2012 115119 12 201125 12 2011125117 12 201223 12 2012 115226 12 201101 01 2012125224 12 201230 12 2012 3 2013 年年2014 年年 周代码周代码周起始日期周起始日期周终止日期周终止日期周代码周代码周起始日期周起始日期周终止日期周终止日期 130131 12 201206 01 2013140130 12 201305 01 2014 130207 01 201313 01 2013140206 01 201412 01 2014 130314 01 201320 01 2013140313 01 201419 01 2014 130421 01 201327 01 2013140420 01 201426 01 2014 130528 01 201303 02 2013140527 01 201402 02 2014 130604 02 201310 02 2013140603 02 201409 02 2014 130711 02 201317 02 2013140710 02 201416 02 2014 130818 02 201324 02 2013140817 02 201423 02 2014 130925 02 201303 03 2013140924 02 201402 03 2014 131004 03 201310 03 2013141003 03 201409 03 2014 131111 03 201317 03 2013141110 03 201416 03 2014 131218 03 201324 03 2013141217 03 201423 03 2014 131325 03 201331 03 2013141324 03 201430 03 2014 131401 04 201307 04 2013141431 03 201406 04 2014 131508 04 201314 04 2013141507 04 201413 04 2014 131615 04 201321 04 2013141614 04 201420 04 2014 131722 04 201328 04 2013141721 04 201427 04 2014 131829 04 201305 05 2013141828 04 201404 05 2014 131906 05 201312 05 2013141905 05 201411 05 2014 132013 05 201319 05 2013142012 05 201418 05 2014 132120 05 201326 05 2013142119 05 201425 05 2014 132227 05 201302 06 2013142226 05 201401 06 2014 132303 06 201309 06 2013142302 06 201408 06 2014 132410 06 201316 06 2013142409 06 201415 06 2014 132517 06 201323 06 2013142516 06 201422 06 2014 132624 06 201330 06 2013142623 06 201429 06 2014 4 2013 年年2014 年年 周代码周代码周起始日期周起始日期周终止日期周终止日期周代码周代码周起始日期周起始日期周终止日期周终止日期 132701 07 201307 07 2013142730 06 201406 07 2014 132808 07 201314 07 2013142807 07 201413 07 2014 132915 07 201321 07 2013142914 07 201420 07 2014 133022 07 201328 07 2013143021 07 201427 07 2014 133129 07 201304 08 2013143128 07 201403 08 2014 133205 08 201311 08 2013143204 08 201410 08 2014 133312 08 201318 08 2013143311 08 201417 08 2014 133419 08 201325 08 2013143418 08 201424 08 2014 133526 08 201301 09 2013143525 08 201431 08 2014 133602 09 201308 09 2013143601 09 201407 09 2014 133709 09 201315 09 2013143708 09 201414 09 2014 133816 09 201322 09 2013143815 09 201421 09 2014 133923 09 201329 09 2013143922 09 201428 09 2014 134030 09 201306 10 2013144029 09 201405 10 2014 134107 10 201313 10 2013144106 10 201412 10 2014 134214 10 201320 10 2013144213 10 201419 10 2014 134321 10 201327 10 2013144320 10 201426 10 2014 134428 10 201303 11 2013144427 10 201402 11 2014 134504 11 201310 11 2013144503 11 201409 11 2014 134611 11 201317 11 2013144610 11 201416 11 2014 134718 11 201324 11 2013144717 11 201423 11 2014 134825 11 201301 12 2013144824 11 201430 11 2014 134902 12 201308 12 2013144901 12 201407 12 2014 135009 12 201315 12 2013145008 12 201414 12 2014 135116 12 201322 12 2013145115 12 201421 12 2014 135223 12 201329 12 2013145222 12 201428 12 2014 5 2015 年年2016 年年 周代码周代码周起始日期周起始日期周终止日期周终止日期周代码周代码周起始日期周起始日期周终止日期周终止日期 150129 12 201404 01 2015160104 01 201610 01 2016 150205 01 201511 01 2015160211 01 201617 01 2016 150312 01 201518 01 2015160318 01 201624 01 2016 150419 01 201525 01 2015160425 01 201631 01 2016 150526 01 201501 02 2015160501 02 201607 02 2016 150602 02 201508 02 2015160608 02 201614 02 2016 150709 02 201515 02 2015160715 02 201621 02 2016 150816 02 201522 02 2015160822 02 201628 02 2016 150923 02 201501 03 2015160929 02 201606 03 2016 151002 03 201508 03 2015161007 03 201613 03 2016 151109 03 201515 03 2015161114 03 201620 03 2016 151216 03 201522 03 2015161221 03 201627 03 2016 151323 03 201529 03 2015161328 03 201603 04 2016 151430 03 201505 04 2015161404 04 201610 04 2016 151506 04 201512 04 2015161511 04 201617 04 2016 151613 04 201519 04 2015161618 04 201624 04 2016 151720 04 201526 04 2015161725 04 201601 05 2016 151827 04 201503 05 2015161802 05 201608 05 2016 151904 05 201510 05 2015161909 05 201615 05 2016 152011 05 201517 05 2015162016 05 201622 05 2016 152118 05 201524 05 2015162123 05 201629 05 2016 152225 05 201531 05 2015162230 05 201605 06 2016 152301 06 201507 06 2015162306 06 201612 06 2016 152408 06 201514 06 2015162413 06 201619 06 2016 152515 06 201521 06 2015162520 06 201626 06 2016 152622 06 201528 06 2015162627 06 201603 07 2016 152729 06 201505 07 2015162704 07 201610 07 2016 152806 07 201512 07 2015162811 07 201617 07 2016 6 2015 年年2016 年年 周代码周代码周起始日期周起始日期周终止日期周终止日期周代码周代码周起始日期周起始日期周终止日期周终止日期 152913 07 201519 07 2015162918 07 201624 07 2016 153020 07 201526 07 2015163025 07 201631 07 2016 153127 07 201502 08 2015163101 08 201607 08 2016 153203 08 201509 08 2015163208 08 201614 08 2016 153310 08 201516 08 2015163315 08 201621 08 2016 153417 08 201523 08 2015163422 08 201628 08 2016 153524 08 201530 08 2015163529 08 201604 09 2016 153631 08 201506 09 2015163605 09 201611 09 2016 153707 09 201513 09 2015163712 09 201618 09 2016 153814 09 201520 09 2015163819 09 201625 09 2016 153921 09 201527 09 2015163926 09 201602 10 2016 154028 09 201504 10 2015164003 10 201609 10 2016 154105 10 201511 10 2015164110 10 201616 10 2016 154212 10 201518 10 2015164217 10 201623 10 2016 154319 10 201525 10 2015164324 10 201630 10 2016 154426 10 201501 11 2015164431 10 201606 11 2016 154502 11 201508 11 2015164507 11 201613 11 2016 154609 11 201515 11 2015164614 11 201620 11 2016 154716 11 201522 11 2015164721 11 201627 11 2016 154823 11 201529 11 2015164828 11 201604 12 2016 154930 11 201506 12 2015164905 12 201611 12 2016 155007 12 201513 12 2015165012 12 201618 12 2016 155114 12 201520 12 2015165119 12 201625 12 2016 155221 12 201527 12 2015165226 12 201601 01 2017 155328 12 201503 01 2016 7 附件附件 2 2 流感监测实验技术操作规范流感监测实验技术操作规范 一 流感监测临床标本的采集 运送 处理及流感病毒株的运输一 流感监测临床标本的采集 运送 处理及流感病毒株的运输 一 流感临床标本的采集 病毒分离成功与否很大程度上取决于临床标本的采集时间 质量 及其保存和运输等环节 多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔 其次为 气管和支气管分泌物及尸检组织 标本采集后应立即放入适当的采样 液中低温保存 常用的采样液有以下三种 pH7 4 7 6 的 Hank s Eagle s 或者 DMEM 培养基 为防止采样液生长细菌和真菌 在采样液中可加入 抗菌素 加入庆大霉素 终浓度为 1mg mL Gibco cat no 15750 078 和 或制霉菌素 终浓度为 50U mL 加入抗菌素以后重新调节 pH 值至 7 4 分装每个采样管 3mL 20 冻存 常用采样方法有以 下几种 1 鼻拭子 将带有聚丙烯纤维头的拭子平行于上颚插入鼻孔 旋转 保持数秒 待拭子头吸收分泌物以后 缓慢转动退出 以另一 拭子拭另侧鼻孔 将拭子头浸入采样液中 弃去尾部 2 咽拭子 用带有聚丙烯纤维头的拭子适度用力擦拭双侧扁桃 体及咽后壁 应避免触及舌部 同样将拭子头浸入采样液中 弃去尾 部 注 注 亦可将鼻 咽拭子收集于同一采样管中 以便提高分离率 减少工作量 8 3 鼻咽抽取物 用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液 先将收集器头部插入鼻腔 接通负压 旋转收集器头部并缓慢退出 收集抽取的粘液 并用 3 5mL 采样液涮洗收集器 3 次 此外 对于尸检组织 必要时采集尸检的肺组织标本进行病毒分 离 二 临床标本运输 新鲜采集的临床标本应在 4 条件下 48h 内运送至流感监测网络 实验室 未能 48h 内送至实验室的 应置 70 或以下保存 标本送 至实验室后 应尽快进行相应实验室检测 48h 内能进行检测的可置 于 4 保存 否则应置 70 或以下保存 冻存的临床采集标本应在冻存的条件下 低温送至实验室 冻存 的标本送到实验室后 应尽快进行相应实验室检测 48h 内能进行检 测的可置于 4 保存 否则应置 70 或以下保存 标本应避免反复冻 融 临床标本采集管建议使用带螺口的塑料管 运输时在包装箱内填 充吸水材料 运输过程中保持标本采集管直立状态 不能倾斜 三 临床标本处理 临床采集标本送至实验室后 须经处理后再进行病毒的分离接种 若为带有聚丙烯纤维的拭子标本 应先将带有聚丙烯纤维的拭子在管 壁反复挤压后取出 鼻咽抽取液 用干净灭菌的毛细吸管在无菌条件下反复吹打收集 的溶液 以便打碎粘液 置 4 待其自然沉淀 5 10min 取上清 上 9 清液可直接接种或低温保存 组织标本的处理 取肺组织标本放至平皿中 用灭菌生理盐水清 洗肺组织 2 3 遍 研磨成组织悬液 配置成 10 20 的组织悬液 2000rpm 离心 10min 加入抗菌素 取上清直接接种 注 注 如原始采样液中未加入抗菌素 应在标本接种前补加 庆大 霉素终浓度为 10mg mL 青 链霉素 终浓度 青霉素 G 100U mL 硫酸 链霉素 100 g mL 混匀后置 4 过夜或作用 2h 后进行接种 临床标本处理后 将原始标本分为三份 一份用于鸡胚接种 一 份用于 MDCK 细胞接种 一份保存待复核用 对于病毒分离阳性的 原始标本 70 至少保存 6 个月 在收到国家流感中心复核鉴定报告 后 按照生物安全有关规定处理 病毒分离阴性的标本随时按生物安 全的有关规定处理 四 血清标本的采集 处理 运输和保存 血清标本多用于流感暴发时的血清学核实诊断 血清标本采集应 该包括急性期和恢复期双份血清 单份血清不能用作诊断 急性期血 样应尽早采集 可在采集病毒分离标本的同时采集 但不能晚于发病 后 7 天 恢复期血样则在发病后 2 4 周采集 一般采集空腹血 1 取一根体积 5mL 以上 无菌的血清管做好标记 并进行登记 登记的内容包括 医院名称 患者姓名 性别 急性期 Acute A 或是恢复期 Convalescence C 采样日期 年 月 日 2 从患者手臂静脉采 5mL 血 放入准备好的上述血清管中 3 放置于室温数小时待血液完全凝固 10 4 1500 2000rpm 离心 10min 收集血清于无菌管中 做好标记 5 无菌条件下采集的血清可置 4 存放 1 周 非无菌条件下采集 的或存放超过 1 周的血清需置 20 或以下保存 应尽量避免反复冻 融 五 流感病毒株的运输 需送国家流感中心实验室检测的流感毒株 在流感监测信息系统 填写 流感毒株送检单 提交并打印送检单 加盖单位公章 在冻存 后 低温条件下 送至国家流感中心进行复核检测 运输时应遵守国 家生物安全的有关规定 1 流感毒株的送检要求 1 流感样病例标本 各网络实验室对所有血凝滴度 1 16 的流感毒株 同时分别上 送国家流感中心和省级疾病预防控制中心 送检量每份不少于 3mL 各网络实验室分离的毒株从标本采集到送至国家流感中心的时间不超 过 1 个月 每个开展病毒分离的网络实验室每年向国家流感中心上送不低于 30 株流感毒株 流感流行季节每月不少于 5 株 2 暴发疫情标本分离到的所有血凝滴度 1 16 的流感毒株 3 各网络实验室对于 HA 阳性 但不能区分型别或亚型的毒 株须在 48h 内送至国家流感中心 2 寄送国家流感中心的流感毒株的包装 运输 11 1 病毒株必须放在大小适合的塑料管里 盖上盖子后不应有 泄漏 2 必须在塑料管上标明病毒的名称 将密闭后的装有毒株的 塑料管放入大小适合的自封袋内密封 3 在监测信息系统录入病毒株的相关信息 并提交 打印 流 感毒株送检单 送检单应加盖送检单位公章 送检单应单独放在防 水的袋子里 4 将装有毒株 送检单的密封袋放入专用运输箱内 或疫苗 冷藏包 然后以柔软物质填充 内衬具吸水和缓冲能力的材料 5 运输时应遵守国家生物安全的有关规定 六 标本的接收 送检的标本 毒株 送到实验室后 由专人在生物安全柜内打开 标本的包装 记录收检日期 送检实验室名称 核对并记录送检标本 毒株 编号是否与送检单相同 收到毒株后 国家流感中心 1 个月 内在监测信息系统对送检单位反馈复核鉴定结果 并根据送检单位需 要 定期反馈纸质报告 二 流感病毒的核酸检测二 流感病毒的核酸检测 一 流感病毒 Conventional one step RT PCR 检测 应用核酸检测技术为疑似流感病毒感染病例诊断提供依据 为流 感病毒的型别和亚型的鉴定提供技术方法 按照规定方法对标本和病 12 毒进行处理和检测 保证检测结果的快速性和可靠性 同时确保样本 不被污染和污染环境 1 生物安全要求 实验室操作应当遵守生物安全实验室的有关生物安全的规定 季 节性流感病毒生物安全二级 疑似高致病禽流感病例标本需在 BSL 2 级实验室操作 采取 BSL 3 级防护 核酸提取及加 RNA 模板可在 BSL 2 级实验室生物安全柜内操作 PCR 反应体系配制在体系配制区 PCR 产物检测在电泳区操作 2 主要试剂 所列厂家仅用作举例 实验室可自行选择 注 引物序列详见表1 3 设备 1 BSL 2生物安全柜 2 可调转速最大至14000rmp的离心机 3 涡旋混合器 4 10 L 100 L 200 L 1000 L量程移液器 5 PCR仪 6 电泳槽和电泳仪 7 凝胶成像系统 4 质量控制 序号试剂名称货号规格生产商 1One step RT PCR kit210212Qiagen 2引物 20 M 2ODTAKARA 3RNase inhibitorN2111Promega 13 1 实验检测所需核酸提取试剂和一步法RT PCR检测试剂不同 批号之间需进行灵敏度的检测 同一试剂不同批次的灵敏度的检测至 少半年一次 2 实验检测除待检标本外还需设置阳性对照及阴性对照 阳 性对照核酸事先应稀释分装 经Real time PCR检测Ct值在30以内 阴 性对照为DEPC处理水Real time PCR检测Ct值为0 5 实验步骤 1 实验注意事项 由于PCR检测灵敏度高 因此必须采取一些预防污染的措施 以 避免假阳性结果的出现 建议采取如下方法 a 核酸提取 反应液配制及检测反应进行应在独立的房间中进行 b 不同的房间配制相应的专用耗材和设备 不可交叉使用 c 配制反应液时 应穿着干净的实验服 带无粉手套进行操作 d 实验操作期间 如怀疑有污染 请更换手套 e 试剂及反应管的盖子应尽可能盖上 2 设备准备 操作台的表面 枪头和离心机应保持洁净 可用5 漂白剂或其 它清洁剂 如可以去除DNA酶的试剂擦拭台面 以减少核酸污染的风 险 3 试剂准备 注意 配制反应液期间 尽量保持所有试剂放置在低温装置中 14 如预冷的冰盒 a 引物配制 将新合成的引物在开盖前短暂离心 12000rpm 15s 用 RNase Free Water 溶解 加水量为 10 总摩尔数 充分混匀 此时引 物浓度为 100pmol L 即 100 M 例如 合成引物 2OD 9 5nmol 则加水量为 10 9 5 95 L 可作为储存液 将 100 M 的引物浓度再 10 倍稀释 配成浓度为 10 M 即可直接用于 PCR 反应 b 引物准备 融化引物 振荡所有引物 短暂离心引物 然后放置在低温装置 上 c Conventional RT PCR试剂 将RT PCR Enzyme Mix放置在低温装置上 融化5 RT PCR Buffer 颠倒混匀 短暂离心5 RT PCR Buffer后放置在低温装置上 4 反应体系配制 a 按照如下组分配制反应体系 组 分体 积 L 5 RT PCR Buffer5 n 10mM dNTP Mixture1 n RT PCR Enzyme Mix1 n RNase Inhibitor0 1 n 上游引物0 5 n 下游引物0 5 n RNase Free Water11 9 n 15 Total20 n b 将上述反应液混匀 分装到 0 2mL PCR 小管中 每管 20 L 分别做好标记 c 加 RNA 模板 在核酸提取区 将上述分装好的 PCR 小管分别加入模板 首先加入阴性对照管 5 L 无菌水 然后分别加标本 RNA 每管 5 L 最后加入阳性 对照 RNA 每管 5 L 5 一步法Conventional RT PCR反应 将上述加好模板的反应管混匀 短暂离心后放入 PCR 仪进行 RT PCR 扩增 反应程序如下 温度时间 分钟 秒 循环数 60 10 001 42 10 001 50 30 001 95 15 001 94 00 30 50 00 30 72 01 00 40 72 10 001 4 6 RT PCR产物检测 a 1 5 琼脂糖凝胶制备 称取 1 5g Agarose 倒入耐热玻璃瓶内 再加入电泳液 1 TBE 100mL 轻轻混匀后加热 使 Agarose 完全 熔化 待 Agarose 胶温度降至 50 60 左右 加入核酸染料 Gold View 5 L 轻轻混匀 不要产生气泡 待胶的温度降至 50 左右 16 时 将其倒入制胶板 插好电泳梳子 待胶完全凝固 约 30 60min 之后 将梳子拔出 b 将制备好的电泳胶放入电泳槽 带梳子孔的一端在阴极 倒 入电泳液 1 TBE 浸过胶面即可 c PCR 产物各取 10 L 加入 2 L 上样缓冲液 6 Loading Buffer 混匀后加入电泳胶孔内 先加 Marker DL 2000 5 L 然 后依次加标本 PCR 产物 再加阴性对照 最后加阳性对照产物 d 电泳电压 100V 约 30 40min 后看结果 e 将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照相 7 结果说明 a 判读前提 阴性对照未扩增得到条带 阳性对照仅扩增得到特 异性条带 b 阳性结果 根据各检测引物电泳时出现相应大小特异性条带 进行结果判断 c 阴性结果 未出现条带 或不在相应位置出现非特异性条带 均判为阴性结果 17 表 1 流感病毒 One Step PCR 检测引物 引物名称碱基组成说明 FluA M F305 TTC TAA CCG AGG TCG AAA CG 3 FluA M R2645 ACA AAG CGT CTA CGC TGC AG 3 用于检测 A 型流感病毒 M 基因 FluB NS F485 5 GGG ACA TGA ACA ACA AAG ATG C 3 FluB NS R9885 TGT CAG CTA TTA TGG AGC TG 3 用于检测 B 型流感病毒 Ns 基因 H1HA F768 5 ACT ACT GGA CTC TGC TGG AAC 3 H1HA R10945 CAA TGA AAC CGG CAA TGG CTC C 3 主要用于检测季节性 H1N1 亚型流感病毒 HA 基因 也 可检出部分甲型 H1N1 流感 病毒 HA 基因 对疑似标本 进行季节性 H1N1 亚型鉴定 时 最好使用 Real time PCR 方法进行检测 以免 造成结果的误判 N1 F1059 5 AAG GGG TTT TCA TAC AGG TAT GGT 3 N1 R11655 TCT GTC CAT CCA TTA GGA TCC 3 主要用于检测季节性 H1N1 亚型流感病毒 NA 基因 也 可检出禽流感 H5N1 亚型病 毒 NA 基因及甲型 H1N1 亚 型流感病毒 NA 基因 H3HA F6715 ATC AGG GAG AGT CAC AGT CTC 3 H3HA R9405 ATG CTT CCA TTT GGA GTG ATG C 3 主要用于检测季节性 H3N2 亚型流感病毒 HA 基因 N2 F779 5 GGA AAT CGT TCA TAT TAG CCC ATT G 3 N2 R955 5 AGC ACA CAT AAC TGG AAA CAA TGC 3 主要用于检测季节性 H3N2 亚型流感病毒 NA 基因 也 可检测出部分禽流感 H9N2 亚型病毒 NA 基因 H5HA F248 5 GTG ACG AAT TCA TCA ATG TRC CG 3 H5HA R647 5 CTC TGG TTT AGT GTT GAT GTY CCA A 3 主要用于检测禽流感 H5N1 亚型流感病毒 HA 基因 AN1 F580 5 TGA AGT ACA ATG GCA TAA TAA CWG ACA C 3 AN1 R918 5 CCA CTG CAT ATA TAT CCT ATT TGA TAC TCC 3 主要用于检测禽流感 H5N1 亚型流感病毒 NA 基因 也 可检测出部分甲型 H1N1 亚 型流感病毒 NA 基因 H9HA F4265 GAA TCC AGA TCT TTC CAG AC 3 H9HA R8085 CCA TAC CAT GGG GCA ATT AG 3 主要用于检测禽流感 H9N2 亚型流感病毒 HA 基因 AN2 F1121 5 CGC TAC GGT TAT GAG ACT TTC AG 3 AN2 R1401 5 ATA TTC GCC CCA TCA GGC CAT GAG 3 主要用于检测禽流感 H9N2 亚型流感病毒 NA 基因 H7 F2455 CCC AAT GTG AYC AAT TCCT 3 H7 R4285 GCT CCA TTR GTT CTG ATT CC 3 主要用于检测禽流感 H7N7 或 H7N3 亚型流感病毒 HA 18 基因 注 所列引物将根据流感流行情况不断进行更新 二 流感病毒 Real time one step RT PCR 检测 应用Real time one step RT PCR核酸检测技术为疑似流感病毒感 染病例诊断提供依据 为流感病毒的型别和亚型的鉴定提供技术方法 按照规定方法对标本和病毒进行处理和检测 保证检测结果的快速性 和可靠性 同时确保样本不被污染和污染环境 1 生物安全要求 实验室操作应当遵守生物安全实验室的有关生物安全的规定 季 节性流感病毒生物安全二级 疑似高致病禽流感病例标本需在 BSL 2 级实验室操作 采取 BSL 3 级防护 核酸提取及加 RNA 模板可在 BSL 2 级实验室生物安全柜内操作 PCR 反应体系配制在体系配制区 PCR 产物检测在电泳区操作 2 试剂及耗材 所列厂家仅用作举例 实验室可自行选择 引物和探针序列见表2 3 设备 1 BSL 2生物安全柜 2 涡旋混合器 3 10 L 100 L 200 L 1000 L量程移液器 序号试剂名称货号规格生产商 1 Ag Path ID TM One step RT PCR kit 4387424500 次AB 2引物 40 M 2ODTAKARA 3探针 10 M 2ODTAKARA 19 4 Real time PCR仪 4 质量控制 1 本实验检测所需Ag Path ID TMOne step RT PCR试剂不同批 号之间需进行灵敏度的检测 同一试剂不同批次的灵敏度的检测至少 半年一次 2 实验检测除待检标本外还需设置阳性对照及阴性对照 阳 性对照核酸事先应稀释分装 经Real time PCR检测Ct值在30以内 阴 对照为DEPC处理水 Real time PCR检测Ct值为0 5 实验步骤 1 实验注意事项 由于Real time PCR检测灵敏度高 因此必须采取一些预防污染的 措施 以避免假阳性结果的出现 建议采取如下方法 a 核酸提取 反应液配制及检测反应进行应在独立的房间中进行 b 不同的房间配制相应的专用耗材和设备 不可交叉使用 c 配制反应液时 应穿着干净的实验服 带无粉手套进行操作 d 实验操作期间 如怀疑有污染 请更换手套 e 试剂及反应管的盖子应尽可能盖上 2 设备准备 操作台的表面 枪头和离心机应保持洁净 可用5 漂白剂或其 它清洁剂 如可以去除DNA酶的试剂擦拭台面 以减少核酸污染的风 险 20 3 试剂准备 注意 配制反应液期间 尽量保持所有试剂放置在低温装置中 如预冷的冰盒 a 引物和探针配制 引物配制 将新合成的引物开盖前短暂离心 12000rpm 15s 用RNase Free Water溶解 加水量为10 总摩尔数 充分混匀 此时引 物浓度为100 M 可作为储存液 将100 M的引物2 5倍稀释 此时浓 度为40 M 可作为工作浓度 探针配制 将新合成的探针管开盖前短暂离心 12000rpm 15s 用 RNase Free Water 溶解 加水量为 10 总摩尔 数 充分混匀 此时引物浓度为 100 M 可作为储存液 将 100 M 的探针 10 倍稀释 此时浓度为 10 M 可作为工作浓度 b 引物和探针准备 融化引物和探针 融化后的引物和探针在避光条件下 可在2 8 下保存3个月 振荡所有引物和探针 短暂离心引物和探针 然后放 置在低温装置上 c Real time RT PCR试剂 将25 RT PCR Enzyme Mix放置在低温装置上 融化2 RT PCR Buffer 颠倒混匀 短暂离心2 RT PCR Buffer后放置在低温装置上 4 反应体系配制 21 a 按照如下组分配制反应体系 引物序列详见附录附表 2 配制方 法详见 Real time PCR 引物制备 SOP 组 分体 积 L 2 RT PCR Buffer12 5 n 25 RT PCR Enzyme Mix1 n 上游引物0 5 n 下游引物0 5 n 探针0 5 n RNase Free Water5 n Total20 n b 将上述反应液混匀 分装到 0 2mL PCR 小管中 每管 20 L 分别做好标记 c 加 RNA 模板 在核酸提取区 将上述分装好的 PCR 小管分别加入模板 首先加入阴性对照管 5 L 无菌水 然后分别加标本 RNA 每管 5 L 最后加入阳性 对照 RNA 每管 5 L 5 一步法Real time RT PCR反应 将上述加好模板的反应管混匀 短暂离心后放入 PCR 仪进行 RT PCR 扩增 反应程序如下 96 孔仪器SmartCycler II 温度时间 分钟 秒 温度时间 分钟 秒 循环数 45 10 00 45 10 001 95 10 00 95 15 001 22 95 00 1595 00 15 60 00 4560 00 60 40 注 SmartCycler II 仪器升降温度设为 1 6 秒 适用此反应条件的 96 孔仪器有 AB7500 7900HT 和 Stratagene 3500P 6 结果说明 a 阴性对照反应得到的荧光曲线不应超过阈值线 应无 Ct 值或 为 Ct 值为零 如果阴性对照产生假阳性则是说明有污染产生 此次 检测结果无效 然后严格按照操作程序重复实验 b 阳性对照的检测结果应为阳性 且 Ct 值在 20 30 之间 如果 阳性对照检测结果未达到要求 则需严格按照操作程序重复试验 c 当所有对照成立 检测标本在 35 个循环内出现荧光信号 则 相应引物和探针阳性 若 Ct 值在 35 40 间 应重复确认 如 Ct 值 还在 40 内可判断为阳性 Ct 值超过 40 视该样本为阴性 d 所有的临床标本 RNP 检测都必须为阳性 且 Ct 值在 35 0 以 内才足可以证明样品的质量是可接受的 如果临床标本 RNP 检测为 阴性 则可能是以下原因 e 临床样本核酸提取不正确导致 RNA 的丢失或临床标本里存在 大量的 RT PCR 反应抑制剂 f 样品中人细胞成分太少 以至于不能检测到 g 反应液配制错误或程序设置错误 h 试剂或仪器失灵 23 表 2 流感病毒检测引物和探针序列 引物 探针名称碱基组成 FluA Forward5 GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C 3 FluA Reverse5 GGG CAT TYT GGA CAA AKC GTC TAC G 3 FluA probe5 TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG 3 H1 F2475 AAC ATG TTA CCC AGG GCA TTT CGC 3 H1 R3615 GTG GTT GGG CCA TGA GCT TTC TTT 3 H1 P2785 GAG GAA CTG AGG GAG CAA TTG AGT TCA G 3 H3 F2935 ACC CTC AGT GTG ATG GCT TCC AAA 3 H3 R4005 TAA GGG AGG CAT AAT CCG GCA CAT 3 H3 P3845 ACG CAG CAA AGC CTA CAG CAA CTG T 3 Flu B Forward5 TCC TCA ACT CAC TCT TCG AGC G 3 Flu B Reverse5 CGG TGC TCT TGA CCA AAT TGG 3 Flu B probe5 CCA ATT CGA GCA GCT GAA ACT GCG GTG 3 SWH1Forward5 GGG TAG CCC CAT TGC AT 3 SWH1Reverse5 AGA GTG ATT CAC ACT CTG GAT TTC 3 SWH1Probe5 TGG GTA AAT GTA ACA TTG CTG GCT GG 3 AH5 Forward5 TGG AAA GTR TAA RAA ACG GAA CGT 3 AH5 Reverse5 YGC TAG GGA R