食物中氨基酸测定方法

1 主题内容与适用范围 本标准规定了用氨基酸自动分析仪测定食物中氨基酸的方法 本标准适用于食物中的天冬氨酸 苏氨酸 丝氨酸 谷氨酸 脯氨酸 甘 氨酸 丙氨酸 缬氨酸 蛋氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 酪氨酸 苯丙氨酸 组 氨酸 赖氨酸和精氨酸等十六种氨基酸的测定 其最低检出限为 10pmol 本标准不适用于蛋白质含量低的水果 蔬菜 饮料和淀粉类食物的氨基酸 测定 2 原理 食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸 经氨基酸分析仪的离子交换柱分 离后 与茚三酮溶液产生颜色反应 再通过分光光度计比色测定氨基酸含量 3 试剂 全部试剂除注明外均为分析纯 实验用水为去离子水 3 1 浓盐酸 优级纯 3 2 6mol L 盐酸 浓盐酸 3 1 与水 1 1 混合而成 3 3 苯酚 须重蒸馏 3 4 混合氨基酸标准液 仪器制造公司出售 0 00250mol L 3 5 缓冲液 3 5 1 pH2 2 的柠檬酸钠缓冲液 称取 19 6g 柠檬酸钠 Na3C6H5O7 2H2O 和 16 5mL 浓盐酸加水稀释到 1000mL 用浓盐酸或 50 的氢氧化钠溶液调节 pH 至 2 2 3 5 2 pH3 3 的柠檬酸钠缓冲液 称取 19 6g 柠檬酸钠和 12mL 浓盐酸加 水稀释到 1000mL 用浓盐酸或 50 的氢氧化钠溶液调节 pH 至 3 3 3 5 3 pH4 0 的柠檬酸钠缓冲液 称取 19 6g 柠檬酸钠和 9mL 浓盐酸加水 稀释到 1000mL 用浓盐酸或 50 的氢氧化钠溶液调节 pH 至 4 0 3 5 4 pH6 4 的柠檬酸钠缓冲液 称取 19 6g 柠檬酸钠和 46 8g 氯化钠 优级纯 加水稀释到 1000mL 用浓盐酸或 50 的氢氧化钠溶液调节 pH 至 6 4 3 6 茚三酮溶液 3 6 1 pH5 2 的乙酸锂溶液 称取氢氧化锂 LiOH H2O 168g 加入冰乙酸 优级纯 279mL 加水稀释到 1000mL 用浓盐酸或 50 的氢氧化钠溶液调节 pH 至 5 2 3 6 2 茚三酮溶液 取 150mL 二甲基亚砜 C2H6OS 和乙酸锂溶液 3 6 1 50mL 加入 4g 水合茚三酮 C9H4O3 H2O 和 0 12g 还原茚三酮 C18H10O6 2H2O 搅拌 至完全溶解 3 7 高纯氮气 纯度 99 99 3 8 冷冻剂 市售食盐与冰按 1 3 混合 4 仪器和设备 4 1 真空泵 4 2 恒温干燥箱 4 3 水解管 耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管 体积 20 30mL 用去离子 水冲洗干净并烘干 4 4 真空干燥器 温度可调节 4 5 氨基酸自动分析仪 5 样品处理 样品采集后用匀浆机打成匀浆 或者将样品尽量粉碎 于低温冰箱中冷冻保 存 分析用时将其解冻后使用 6 分析步骤 6 1 称样 准确称取一定量样品 精确到 0 0001g 均匀性好的样品如奶粉等 使样 品蛋白质含量在 10 20mg 范围内 均匀性差的样品如鲜肉等 为减少误差可适 当增大称样量 测定前再稀释 将称好的样品放于水解管中 6 2 水解 在水解管内加 6mol L 盐酸 3 2 10 15mL 视样品蛋白质含量而定 含水 量高的样品 如牛奶 可加入等体积的浓盐酸 加入新蒸馏的苯酚 3 3 3 4 滴 再将水解管放入冷冻剂中 冷冻 3 5min 再接到真空泵的抽气管上 抽真空 接近 0 psi 然后充入高纯氮气 再抽真空充氮气 重复三次后 在充氮气 状态下封口或拧紧螺丝盖将已封口的水解管放在 110 1 的恒温干燥箱内 水 解 22h 后 取出冷却 打开水解管 将水解液过滤后 用去离子水多次冲洗水解管 将水解液全 部转移到 50mL 容量瓶内用去离子水定容 吸取滤液 1mL 于 5mL 容量瓶内 用真 空干燥器在 40 50 干燥 残留物用 1 2mL 水溶解 再干燥 反复进行两次 最后蒸干 用 1mL pH2 2 的缓冲液 3 5 1 溶解 供仪器测定用 7 测定 准确吸取 0 200mL 混合氨基酸标准 3 4 用 pH2 2 的缓冲液 3 5 1 稀释 到 5mL 此标准稀释液浓度为 5 00nmol 50 L 作为上机测定用的氨基酸标准 用氨基酸自动分析仪以外标法测定样品测定液的氨基酸含量 8 计算 式中 X 样品氨基酸含量 g 100g c 样品测定液中氨基酸含量 nmol 50 L F 样品稀释倍数 V 水解后样品定容体积 mL M 氨基酸分子量 m 样品质量 g 109 将样品含量由 ng 折算成 g 的系数 注 样品氨基酸含量在 1 00g 100g 以下 保留两位有效数字 含量在 1 00g 100g 以上 保留三位有效数字 十六种氨基酸分子量 天冬氨酸 133 1 苏氨酸 119 1 丝氨酸 105 1 谷氨酸 147 1 脯氨酸 115 1 甘氨酸 75 1 丙氨酸 89 1 缬氨酸 117 2 蛋氨酸 149 2 异亮氨酸 131 2 亮氨酸 131 2 酪氨酸 181 2 苯丙氨酸 165 2 组氨酸 155 2 赖氨酸 146 2 精氨酸 174 2 9 允许差 同实验室平行测定或连续两次测定结果相对偏差绝对值 12 10 其他 10 1 测定条件 以 Beckman 6300 型氨基酸自动分析仪为例 缓冲液流量 20mL h 茚三酮流量 10mL h 柱温 50 65 和 70 色谱柱 20cm 分析时间 42min 10 2 标准出峰顺序和保留时间 图略 10 3 标准图谱 图略 附录 A 其他型号氨基酸自动分析仪特点 参考件 A1 测定条件 HITACHI HITACHI 835 50 L 8500 缓冲液流量 mL min 0 225 0 4 茚三酮流量 mL min 0 3 0 3 柱温 53 57 色谱柱 mm 4 150 4 6 60 分析时间 min 50 30 最低检出限 pmol 30 10 A2 标准出峰顺序和保留时间 HITACHI HITACHI 835 50 L 8500 出峰顺序 保留时间 min 1 天冬氨酸 9 88 5 90 2 苏氨酸 10 86 6 56 3 丝氨酸 11 88 7 22 4 谷氨酸 13 52 8 15 5 脯氨酸 14 34 8 86 6 甘氨酸 18 38 11 25 7 丙氨酸 19 77 12 08 8 缬氨酸 22 90 13 38 9 蛋氨酸 24 64