MTT实验指导-大汇总

精品文档 1欢迎下载 MTT 大汇总 实验前应明确的问题实验前应明确的问题 1 选择适当的细胞接种浓度 一般情况下 96 孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有 105个 细胞 但由于不同细胞贴壁后面积差异很大 因此 在进行 MTT 试验前 要进行预实验检 测其贴壁率 倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线 确定试验中每孔的接种细 胞数和培养时间 以保证培养终止致细胞过满 这样 才能保证 MTT 结晶形成酌量与细胞 数呈的线性关系 否则细胞数太多敏感性降低 太少观察不到差异 2 药物浓度的设定 一定要多看文献 参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛 根据 自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛 切记 否则 可能你用的时间和浓度根本不 是药物的有效浓度和时间 3 时间点的设定 在不同时间点的测定 OD 值 输入 excel 表 最后得到不同时间点的抑 制率变化情况 画出变化的曲线 曲线什么时候变得平坦了 到了平台期 那个时间点应 该就是最好的时间点 因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显 4 培养时间 200ul200ul 的培养液对于的培养液对于 1010 的的 4 54 5 次方的增殖期细胞来说 很难维持次方的增殖期细胞来说 很难维持 68h68h 如果 营养不够的话 细胞会由增殖期渐渐趋向 G0 期而趋于静止 影响结果 我们是在 48h 换液 的 5 MTT 法只能测定细胞相对数和相对活力 不能测定细胞绝对数 做 MTT 时 尽量无菌操 作 因为细菌也可以导致 MTT 比色 OD 值的升高 6 理论未必都是对的 要根据自己的实际情况调整 7 实验时应设置调零孔 对照孔 加药孔 调零孔加培养基 调零孔加培养基 MTTMTT 二甲基亚砜 二甲基亚砜 对照孔 和加药孔都要加细胞 培养液 MTT 二甲基亚砜 不同的是对照孔加溶解药物的介质 而 加药组加入不同浓度的药物 8 避免血清干扰 用含 15 胎牛血清培养液培养细胞时 高的血清物质会影响试验孔的光 吸收值 由于试验本底增加 会试验敏感性 因此 一般选小于 10 胎牛血清的培养液进 行 在呈色后 尽量吸净培养孔内残余培养液 实验步骤实验步骤 贴壁细胞 1 收集对数期细胞 调整细胞悬液浓度 每孔加入 100ul 铺板使待测细胞调密度至 1000 10000 孔 边缘孔用无菌 PBS 填充 2 5 CO2 37 孵育 至细胞单层铺满孔底 96 孔平底板 加入浓度梯度的药物 原则 上 细胞贴壁后即可加药 或两小时 或半天时间 但我们常在前一天下午铺板 次日上 精品文档 2欢迎下载 午加药 一般 5 7 个梯度 每孔 100ul 设设 3 53 5 个复孔个复孔 建议设建议设 5 5 个 否则难以反应真实情个 否则难以反应真实情 况况 3 5 CO2 37 孵育 16 48 小时 倒置显微镜下观察 4 每孔加入 20ulMTT 溶液 5mg ml 即 0 5 MTT 继续培养 4h 若药物与 MTT 能够反应 可先离心后弃去培养液 小心用 PBS 冲 2 3 遍后 再加入含 MTT 的培养液 5 终止培养 小心吸去孔内培养液 6 每孔加入 150ul 二甲基亚砜 置摇床上低速振荡 10min 使结晶物充分溶解 在酶联免 疫检测仪 OD490nm 处测量各孔的吸光值 7 同时设置调零孔 培养基 MTT 二甲基亚砜 对照孔 细胞 相同浓度的药物溶解介 质 培养液 MTT 二甲基亚砜 MTTMTT 的配制的配制 MTT 一般最好现用现配 过滤后 4 度避光保存两周内有效 或配制成 5mg ml 保存在 20 度 长期保存 避免反复冻融 最好小剂量分装 用避光袋或是黑纸 锡箔纸黑纸 锡箔纸包住避光以免分 解 我一般都把 MTT 粉分装在 EP 管里 用的时候现配 直接往培养板中加 没必要一下子 配那么多 尤其当当 MTTMTT 变为灰绿色时就绝对不能再用了 变为灰绿色时就绝对不能再用了 MTTMTT 有致癌性有致癌性 用的时候小心 有条件最好带那种透明的簿膜手套 配成的 MTT 需要无菌 MTT 对菌很敏感 往 96 孔板加时不避光也没有关系 毕竟时间较短 或者你不放心的时候 可以把操作台上的照明灯关掉 配制 MTT 时用用 PBS 溶解 也有人用生理盐水配 60 水浴助溶 PBSPBS 配方 配方 NaClNaCl 8g8g KclKcl 0 2g0 2g Na2HPO4Na2HPO4 1 44g1 44g KH2PO4KH2PO4 0 24g0 24g 调调 phph 7 47 4 定容定容 1L1L 关于细胞的接种 铺板 关于细胞的接种 铺板 细胞过了 30 代以后就不要用了 因为状态不好了 培养板要用好的 最好进口板 不好 的板或重复利用的板只可做预实验重复利用的板只可做预实验 接种时最好按照预实验摸索出的密度接种 因为细胞密度在 10000 ml 左右时 所测得的 OD 值的区间即细胞抑制率 或者增值率 的所呈现的线性关系最好 结果最可信 如果铺 的太稀细胞的杀伤不会很明显 太密细胞可能都会凋亡 因为细胞长的太快营养会不够 精品文档 3欢迎下载 最后导致死亡 且而细胞过密或者过少 增殖都会过快或者过慢 其增值率线性关系不佳 故而MTTMTT 细胞密度多采用细胞密度多采用 10000 ml10000 ml 100ul 100ul 孔 孔 细胞密度要根据不同细胞的特点来定 如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细 胞浓度 如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度 这样与对照的区别 更明显 数据更好 悬浮细胞每孔的细胞数可达到悬浮细胞每孔的细胞数可达到 105105 贴壁细胞可为 贴壁细胞可为 103 104 103 104 其它的声音 1 首先细胞的接种密度一定不能过大 一般每孔 1000 个左右就够了 我认为宁少勿多宁少勿多 尤其是对于肿瘤细胞 10000 孔是太高了 这样即使药物有作用 MTT 方法也是表现不出 的 最佳点板浓度在 4000 5000 孔 太少的话 SD 值会很大 2 MTT 本身就是比较粗的实验 增殖率 10 左右的波动都不算奇怪 特别是新手 20 的波 动也是常见的 所以很可能是技术原因引起的 特别是种板技术一定要过关 3 我做的是肿瘤细胞的 MTT 实验 这种细胞长的很快一开始我是用 100000 ML 的浓度来接 种的 结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系 后来调整浓度 用过 40000 80000 ML 的浓度都做过 MTT 实验 结果发现做的结果比较好点的是 60000 70000 ML 的浓度组的 用 40000 M 的浓度的组 由于细胞少 药物作用的梯度还是有 只是没有很好 的线性关系 还有根据细胞生长速度以及药物的特性 有时间依赖性和浓度依赖性的药物 来确定培养时间是 48 小时还是 72 小时 注意细胞悬液一定要混匀 已避免细胞沉淀下来 导致每孔中的细胞数量不等 可以每接 几个就要再混匀一下 加样器操作要熟练 尽量避免人为误差 虽然移液器比移液管精确 得多 但是如果操作不熟 CV 会在 8 左右 另外 吹散次数过多也会影响细胞活力吹散次数过多也会影响细胞活力 所 以要熟练鞋 快些上板 首先说说我的一点经验 1 吹打时悬液总量不能太多 达到吸管吸液量的 3 到 4 倍 可能比较容易混匀 10ml10ml 的的 离心管里面最好装离心管里面最好装 3 4ml3 4ml 的悬液的悬液 悬液太少容易吹起很多气泡 悬液太多又不容易吹成单 细胞悬液 2 同时每次吸管的吸液量最好在同时每次吸管的吸液量最好在 1ml1ml 左右左右 吸液量过多的话 一下吸起很多液体 管中所 剩就很少 这样吹打容易起泡 吸液量过少 吹打的力度就不够 吹打就会不均匀 如果 是吸液量 1ml 多的吸管 总液量在 5ml 左右为益 3 吸的时候要在悬液底部 然后提起来一点 但是吹下去的时候不要离开液面 否则容易 吹打出气泡 4 吹打次数吹打次数 100100 左右 就可以吹打均匀了 有人认为加细胞前吹打左右 就可以吹打均匀了 有人认为加细胞前吹打 30 5030 50 次基本就差次基本就差 不多均匀了 加细胞的时候每接种不多均匀了 加细胞的时候每接种 2 2 孔反复吹打孔反复吹打 3 3 次 每吹打次 每吹打 3 3 次后枪头垂悬与细胞次后枪头垂悬与细胞 精品文档 4欢迎下载 悬液中悬液中 5 5 秒钟 然后再以一定的速度吸取悬液 秒钟 然后再以一定的速度吸取悬液 5 向每孔中用枪头加入细胞时不要太快 否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲 力在孔底聚集一堆 一般都在孔的底部中央 而周边很少 这种不均匀的分散会产生接触 抑制 影响细胞的生长 所以速度不能太快也不能太慢 我习惯每块板加完后平握手我习惯每块板加完后平握手 中 向左中 向左 3 3 下 向右下 向右 3 3 下 在往返回复下 在往返回复 3 3 下移动 目的是使得细胞能分散的均下移动 目的是使得细胞能分散的均 匀些 匀些 铺板技术是 铺板技术是 MTTMTT 实验的关键 也是基础 一定要练好 实验的关键 也是基础 一定要练好 曾经有同学用漩涡 振荡器混匀细胞 最后细胞全死了 建议不要采用这种方法混匀细胞 加入加入 MTTMTT 个人认为 MTT 最关键的是你的细胞数目和你加入真正起作用的的 MTT 的适当比例 具体细 胞数目和真正起作用的的 MTT 之间的关系确实不好确定 我认为 MTT 多加一些比少加好一 些 MTT 的量各家报道不同 一般是过量的 所以10ul10ul 即够了即够了 如果不使用 96 孔板 培养基 超过 100ul MTT 按照 10 的比例加入 加入 MTT 以后振荡一下让 MTT 与培养基混匀 不过 这个应该关系不大 如加入如加入 MTTMTT 后都有个别孔立即变为蓝黑色 则污染的可能性極大 后都有个别孔立即变为蓝黑色 则污染的可能性極大 另外 MTT 稀釋 後加入細胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜 且在加 MTT 前可以先在镜下观察 看看是否 有孔染菌 染菌的孔常常是临近的 因为血清中白蛋白对大部分的药物都有结合效应 所以可以单独将药物和 MTT 加在一起 看会不会起反应 如果不起反应 就不用去除含药物的培液 直接加 MTT 即可 如何清除上清如何清除上清 百家争鸣 1 加 DMSO 前要把液体吸掉 但培养液里的紫色结晶可能会吸去 可在这之前先用平板离 心机离心 96 孔板 2000r 5 分钟 然后吸掉上清 如果是悬浮细胞 则推荐此法 悬浮 细胞要离心 2500rpm 10min 且其做 MTT 最好用圆底型 96 孔板 清除上清时注意不要把下 面的结晶颗粒吸掉 建议各孔吸弃 150 160ul 即可 2 我每次将 MTT 加入后 再孵育四个小时 然后用离心机离心 1000G 5min 但是用枪小 心地吸上清 还是会将一小部分蓝色结晶吸出 所以还是建议翻转倒扣的方法吧 3 另外 可以直接将板翻转倒扣 垫几层滤纸 2 3 次 比用 吸 的办法更不容易 使细胞脱离出来 可以轻拍 或者倾斜一点帮助吸液 发现紫色结晶几乎没有肉眼可 见的掉脱 但前提是你本身细胞贴壁要比较牢 半贴壁生长的细胞容易脱离 假如药 物作用时间长的话 阴性对照组可能由于细胞过多而使加入 MTT 后形成的结晶漂起来 这样就不能直接倒掉上清 必须是贴壁细胞 必须是贴壁细胞 精品文档 5欢迎下载 4 做 MTT 时 这一步骤一定要小心 不要采用倒的方式 因为贴壁不牢的细胞会被倒掉 从而影响 OD 值 悬浮细胞 不要翻板 离心后也不要翻板 这个方法害死人 5 加完 MTT 反应 3 4h 后 从培养箱取出 96 孔板的动作要轻柔 避免振荡结晶 使其滑落 你 可以试着将 96 孔板倾斜 30 度角 然后用枪尖慢慢吸 有的细胞可以用排枪一起吸 有的 则要耐心的一个个用枪头吸 枪尖的力度和方向要保证每个孔都一致 不要让枪头接触 到孔底 且一旦倾斜孔板后就不要反复倾斜放平 这样也会使结晶脱落 6 用医用的注射器加上针头吸取液体的用医用的注射器加上针头吸取液体的 吸取时要把板子斜放 沿着壁吸 取就好了 这次 MTT 我用 1ml 针头仔细吸培养液 觉得比其它方法可靠 一般不会吸走紫 色结晶 避免清除上清而改进的方法 由于一般可离心 96 孔板的离心机不好找 既使是贴壁细胞做 MTT 时 用 DMSO 溶解得到结 果也不好 不是得不到预期结果就是可重复性差 解决方法 1 用以下文献方法 周建军等 评价抗癌物质活性的改良 MTT 方法 中国医药 工业杂志 1993 24 10 455 457 具体方法 配三联溶解液 10 SDS 5 异丁醇 0 012mol LHCL 蒸馏水溶解 三联溶解液 三联溶解液 SDS10gSDS10g 异丁醇 异丁醇 5ml5ml 10M10M HClHCl 0 1ml0 1ml 用双蒸水溶解配成用双蒸水溶解配成 100ml100ml 溶液溶液 操作 在培养板上加一定密度的细胞悬液 90ul 孔 如需给药 则再于同时 悬浮细胞 或 4h 后 贴壁细胞 加入不同浓度的药物 10ul 孔 均设三复孔 另外 每块板上另没一 个调零孔 只加培养液 不含细胞和药物 培养 2d 后 加入 MTT 溶液 20ul 孔 继续培 养 4h 然后加入上述三联液 100ul 孔 于 37 度放置过夜后 用酶标仪测各孔 A570 值 优点 简化操作 提高了可靠性 解决方法 2 日本同仁有一种新试剂 CCK 8 试剂 CCK 8 试剂可用于简便而准确的细胞增 殖和毒性分析 其基本原理为 该试剂中含有 WST 8 其化学名称为 2 2 甲氧基 4 硝 基苯基 3 4 硝基苯基 5 2 4 二磺酸苯 2H 四唑单钠盐 它在电子载体 1 甲 氧基 5 甲基吩嗪 硫酸二甲酯 1 Methoxy PMS 的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为 具有高度水溶性的黄色甲 染料 Formazan dye 生成的甲物的数量与活细胞的数量成正 比 因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析 CCK 8 试剂中已预先配入了进行 细胞增殖和毒性分析所需的成分 无需再用缓冲液或培养基进行稀释 同时 CCK 8 试剂 无需任何放射性同位素和有机溶剂 因此 无需特别的技巧 就可使每一位使用者准确 快速地得到重现性好的实验结果 解决方法 3 使用 MTS 精品文档 6欢迎下载 解决方法 4 加入 DMSO 在同一批实验中最好不要更换 DMSO 加加 DMSODMSO 前把孔中液体尽量弃干净 没有去掉前把孔中液体尽量弃干净 没有去掉 上清直接加上清直接加 DMSODMSO 一是沉淀会很难溶解 一是沉淀会很难溶解 二培养液的颜色在检测时也能被测到 二培养液的颜色在检测时也能被测到 会对最后结果造成影响 会对最后结果造成影响 但前提是不能把细胞也一起吸掉 因为这样带来的误差要远 远大于培养液没弃干净带来的误差 所以要在保证细胞不被吸掉的前提下 尽量把培养液 吸掉 如果培养液没弃干净 空白孔也要留有等量的培养液 这样在检测时可以尽量去除 培养液的影响 DMSO 的量也可为 100ul 或 150ul 1 加了 DMSO 后用振荡器轻轻振荡 5 10min 时间控制尽量严格一点 放置时间长了会影 响结果 值会偏大 且结果不可信 2 加入 DMSO 后可用排枪反复抽吸助溶 溶解后尽快检测 如果实验孔不多 建议用此法 因其比振荡溶解效果好 3 或放入 37 度放孵箱 15 分钟溶解结晶 振荡是为了让甲臜溶解 这样才能更好的测量吸光度 振荡 96 孔板有专的振荡器 目的 扎破气泡 有气泡存在时 由于其对光的反射与折射作用 酶标仪的原理是通过测定特定波 长透过样品的吸光度推测样品内特定物质的浓度 会导致结果偏移 ODOD 值的测定值的测定 至于测定波长的选择是因显色溶液而异的 对于 DMSO 溶解后呈紫 红 色 490nm 有最 大吸收值 而 ATCC 公司的 MTT 试剂盒用的不是 DMSO 它的测定波长是 570 就如 ELISA 实验选用 OPD 作底物测定波长是 492 选用 TMB 显色液则用 450 而对于 SDS 和酸化异丙 醇 则选用 570nm 并且建议以 655nm 作为参考波长 DMSO 溶后 10 分钟内测 越放颜色越深 而 SDS 做为溶解液测吸收光值 其值可在三天内 保持不变 细胞密度偏大测出的吸光度也会偏大 细胞密度小吸光度也会偏小 另外跟细胞状态也有 关系 细胞状态不好的话 吸光度值也会低的 细胞数目少 或者是培养的时间短 OD 值 也会偏低 如果各个孔的孔间差异性特别明显的话说明有可能存在污染 空白孔的 OD 值太 高 很可能是细菌污染 复孔直接的复孔直接的 ODOD 值差别一般应在值差别一般应在 0 1 0 150 1 0 15 差别太大考虑 1 接种细胞数不均匀 或 是接种太多 应保证每孔一致 一般是每孔 1000 10000 个 可以细胞细胞计数后 加入细 胞悬液 再补培养基到预定体积 并轻轻吹打几次 使细胞均匀分布 这样比直接加入预 定体积的细胞悬液要好 接种时应加含血清培养基 2 贴壁时间 18 24h 如果不够 悬 浮的细胞会被吸掉 一般为了实验的准确 每个浓度可以设一般为了实验的准确 每个浓度可以设 5 65 6 个复孔 可以最后统计时 可以除个复孔 可以最后统计时 可以除 去一个最高值和一个最低值 或者除去其中数据离谱的值去一个最高值和一个最低值 或者除去其中数据离谱的值 这些离谱数字的出现 精品文档 7欢迎下载 与细胞是否污染 细胞是否在培养期间死去 是否培养液蒸发过多 加 MTT 液是否准确 在 37 5 二氧化碳培养箱中孵育时间是否一定 1 4 小时 等有密切的关系 当然测定 OD 值的仪器工作状态是否正常也非常重要 一般开机预热 20min MTT 方法的吸收度在 0 2 0 8 之间误差较小 这和分析化学中的 lambert beer 定律有关 对朗伯 比尔定律的偏离在吸光光度分析中 经常出现标准曲线不呈直线的情况 特别是当 吸光物质浓度较高时 明显地看到通过原点向浓度轴弯曲的现象 吸光度轴弯曲 这种情 况称为偏离朗伯 比尔定律 若在曲线弯曲部分进行定量 将会引起较大的误差 在吸光光 度分析中 仪器测量不准确也是误差的主要来源 任何光度计都有一定的测量误差 这些 误差可能来源于光源不稳定 实验条件偶然变动 读数不准确等 在光度计中 透射比的标尺刻度均匀 吸光度标尺刻度不均匀 对于同一仪器 读数的波 动对透射比为一定值 而对吸光度读数波动则不再为定值 吸光度越大 读数波动所引起 的吸光度误差也越大透射比很小或很大时 浓度测量误差都较大 即光度测量最好选吸光 度读数在刻度尺的中间而不落两端 待测溶液的透射比 T 在 15 65 之间 或使吸光度 A 在 0 2 0 8 之间 才能保证测量的相对误差较小 当 A 0 434 或透射比 T 36 8 时 测 量的相对误差最小 其它的声音 1 最好用 570nm 波长的滤光片 因为 MTT 在这个波长的吸光度是峰值 换句话说灵敏度高 用其它波长的也有 一般是 490nm 但我的经验灵敏度降低一半 2 我们用的 BIO TEK 公司的 ELx800 一般值在 2 以下都是可靠的 如果复孔之间值相差 太大就要考虑是否是实验过程中的误差 我曾经看到园子的有些帖子报道说 OD 值大概在 0 2 1 2 范围内与活细胞数有较好的线性关系 但ODOD 值在值在 0 3 0 90 3 0 9 范围内可能更佳 范围内可能更佳 若你的若你的 ODOD 值不在这个范围内则你实验的细胞数可能不太合适 应调整你的细胞值不在这个范围内则你实验的细胞数可能不太合适 应调整你的细胞 数 数 边缘效应 96 孔板四周一圈的孔一般只做空白 不养细胞 否则这四行的数据会偏高或偏低 96 孔板在培养箱中 由于湿度不够 而培养箱由于具有一定的温度 由于温度梯度使得边缘 的孔水分蒸发较快 导致培养基中各种成分浓度变化增大 导致细胞状态不同 对于这种 现象 要保证培养箱中的湿度 减少开关培养箱的次数和时间 解决方法 将孔板周围的 一圈孔全部不用 影响非常大 而且最外一圈一定要加水 最外一圈一定要加水 PBSPBS 或者培养液 只要或者培养液 只要 能防止蒸发就可以能防止蒸发就可以 关于如何计算 IC50 1 改良寇式法 lgIC50 Xm I P 3 Pm Pn 4 Xm lg 最大剂量 I lg 最大剂量 相临剂量 P 阳性反应率之和 Pm 最大阳性反应率 Pn 最小阳性反应率 精品文档 8欢迎下载 举个例子 各组浓度 0 1 0 01 0 001 0 0001 0 00001 0 000001 稀释倍数为 10 最大浓度为 0 1 抑制率为 0 95 0 80 0 65 0 43 0 21 0 06 代入 计算公式 Pm 0 95 Pn 0 06 P 0 95 0 80 0 65 0 43 0 21 0 06 3 1 Xm lg0 1 1 lgI lg0 1 0 01 1 lgIC50 1 1 3 1 3 0 95 0 06 4 3 6025 IC50 0 00025 2 Bliss 法 自己查阅书籍 3 IC50 计算软件 见下面附件 4 自己用 EXCEL 做趋势线来求 IC50 关于 LD50 的方法与此相似 5 在线求 IC50 或 EC50 http chiryo phar nagoya cu ac jp javastat JavaStat j htm 结果统计学处理 所有数值以 x s 表示 应用 SPSS 软件进行方差分析 p 0 05 时为相差显著 p 0 01 时为 相差非常显著 可以以时间为横轴 光吸收值为纵轴绘制细胞生线 专门公式求 IC50 或 计算抑制率 细胞死亡率 OD 对照组 OD 实验组 OD 对照组 excel 表中可以做两两比较的 T test 这个你可以参考一下 你的数据应该用多个样本均 数的 T test 方差分析也可 用的软件是 SPSS 或者 SAS 孔板的重复利用 培养板要用好的 最好进口板 不好的板或重复利用的板只可做预实验 一般贴壁生长的 细胞用重复利用的培养板效果不是很好 因为培养板表层在生产时涂有一层促进细胞贴壁 的物质 在清洗后多半会失去 悬浮或是半悬浮生长的细胞还可以 建议不要用太多次 即使是进口的板子使用次数也不要超过 3 次 底值最好在测得值的 1 3 一下 强烈建议培养板不要重复使用 1 泡酸是可以 但是泡完酸的板子很不利于细胞的生长 会出现帖壁不好 细胞生长缓慢等情况 2 这样的板子消毒灭菌很不彻底 如果有万一 则因小失大 3 重复用的板子洗不干净在培养过程中易出现杂质 重复利用时 做法 1 洗净后用 2 NaoH 浸泡 4 小时 再用 1 稀盐酸浸泡 4 小时 冲洗 15 遍 蒸馏水冲洗 3 遍 烘干 UV 照射过夜 紫外 2 小时以上消毒即可 做法 2 精品文档 9欢迎下载 泡酸 2 4 小时 老师让我们别超过 4 小时 普通的玻璃仪器是过夜 捞出 冲洗干净 烘干后 UV 照射过夜 估计跟其他收集在一起 钴 60 照射消毒 做法 3 1 做完 MTT 后用大水流尽量将板冲净 然后用洗衣粉水泡几个小时 小心最好让洗衣粉先 化开 2 用自来水冲净洗衣粉水 倒扣晾干 3 重铬酸钾加浓硫酸配成的酸液中浸泡过夜泡洗液 六小时以上即可 后自来水洗净 20 次左右 每个孔都要处理 4 用去离子水冲洗 3 遍 双蒸水冲洗 3 遍 烤干 5 超净台中紫外线照射 2 个小时左右 就可以用了 不可以高压 做法 4 1 测完值的 96 孔板甩掉孔内培养液 放入超声中超 10 30 分钟 晾干 或烘干 备用 此步骤可最大程度的洗去污垢及细胞 2 每孔加入 50 100ul 的胰酶 0 05 我一般加 60ul 加完胰酶后水平振荡 96 孔板以 使胰酶均匀覆盖于细胞表面 室温下放置至细胞被消化脱落为止 假如你想消化快一点的 话可将 96 孔板放到 37 度培养箱内 胰酶在 37 度时的活力最大 对于顽固贴附在壁上的细胞 此步骤最为有效 3 甩掉胰酶 自来水下冲洗 晾干 或烘干 备用 如果不烘干就泡酸 那么 96 孔板残留的水分将稀释酸液 长期以往泡酸的效果下降 4 将晾干的 96 孔板泡酸 中强酸 过夜 捞起后自来水下冲洗 10 遍 双蒸水冲洗 3 遍 三蒸水冲洗 3 遍 烘干备用 泡酸时特别注意时间不要太长了 否则板子变黄 影响最后 的 OD 值的测定 5 做实验前 96 孔板至少在紫外灯下照射 30 分钟 但不能长期照射 紫外线长期照射可 使板变黄 我的两块板放在超静台上忘了拿出来 一直照了两个星期 等我从超静台上取 出板已经变成黄色 注 1 在实验中若你测得某一个孔的数值偏高 虽然有很多因素会导致数值偏高 但是如果是 板底的污点引起的话你可以消除 拿出 96 孔板擦一擦值偏大孔的板底部 再测值 你会发 现孔高的值又会到正常水平 因为咱们做实验时手不可避免的接触 96 孔板板底留下痕迹 这些痕迹就会使吸光度升高 2 96 孔板洗的次数多了 板底自然留下划痕 这就会导致读数的不均而影响实验结果 你不妨在做实验前测一次 96 孔板的值 此值为初值 实验测得的为后值 后值减去初值 就接近实验的真实值 MTT 实验心得 MTT 实验是检测细胞活力的实验方法 由于细胞活力与细胞数呈正相关 因此也常常用来 检测细胞的增殖情况 MTT 的原理 活细胞有琥珀酸脱氢酶 将 MTT 还原成棕褐色沉淀 由于一般介绍园子里已经很多 笔者将自己的心得按照实验流程与大家交流交流 精品文档 10欢迎下载 1 培养好细胞点板 养细胞没啥好说的 如果不知道细胞如何养 那就看看相关的文献方法 如果知道了细胞 的名字 就可以上www atcc orgwww atcc org检索细胞的培养信息 这个网站上的培养方法是 标准培养方法 当然可以根据自己实验要求进行修改 由于细胞计数很繁琐 点板时的细 胞浓度是最难掌握的 这一点笔者的心得如下 自己先将细胞养一段时间 大概了解细胞 的增殖情况 在 MTT 检测时实际上要求细胞大概能长满 96 孔板的 80 90 如果打算养 48 小时就检测 根据细胞的生长情况反推点板时的细胞浓度状况 这时可以将细胞不进行计 数 将消化好的细胞混匀后 可能是 10 ml 直接在一个废弃 最好进行过无菌处理 的 96 孔板中依次加入 180 100 50 微升细胞 将细胞放置几分钟就会沉到板底了 这时在 显微镜下观察 推测哪个孔的细胞 48 h 能基本长满板底 假设 50 微升的孔比较合适 而 点板时每孔需点 200 微升 那么就将细胞浓度再稀释 4 倍就可以正式点板了 这时顺便将 细胞进行计数 因为实验记录要求写啊 这样就 OK 了 如果细胞还太多 将细胞稀释 4 倍后再重复以上操作 注意 不要过分信赖细胞计数 因为细胞计数的取样量为 20 微升 左右 由于颗粒的分布不均匀 代表性是很差的 建议 细胞计数一定要会 但不要完全 依赖它 点板时一定要将细胞消化成单个细胞 而且一定要混匀 最好用排枪 否则 MTT 的 SD 会狂大 2 点板布局 其实这一点很多人不懈一顾 如果你的细胞要养 48 h 或更长 建议不要吝啬 96 孔板的四 周边孔 这 32 个边孔不能使用 建议加入灭菌 PBS 以饱和中间 64 个孔的水分 因为细胞 培养过程中 边孔的水分蒸发很快 培养液及里面的药物会出现浓缩现象 细胞的状况就 复杂了 有些人称之为 边缘效应 这些孔的 SD 也会狂大 既然如此 不如不用 3 加 MTT 如果确认你考察的药物没有氧化还原性氧化还原性 你可以直接加入 MTT 溶液 总体积的 1 10 如 果你没有把握 建议在加 MTT 前换一次液 如果你肯定考察的药物的氧化还原性很强 比 如谷胱甘肽 Vit E VitC 那建议你用 PBS 将细胞洗洗 否则这些药物会将 MTT 还原成棕 褐色沉淀 这种效果可能是你不需要的 4 加入 MTT 后的反应 时间为 3 4h 此时弃去各孔中的液体在加入 200 微升的 DMSO 为了将沉淀溶解完全 尽可 能将水弃除干净 加入 DMSO 后在摇床上震摇 10min 提醒 如果你的细胞贴壁不好 此时 的沉淀在弃去液体时易丢失 因此贴壁不好的细胞在点板时记得将 96 孔板用多聚赖氨酸处 理处理 要么在弃液体时先用甩板机离心 再轻轻弃去液体 关于 DMSO 的量 每孔的体积 有点儿差异不干扰检测 只要能将沉淀完全溶解就行了 至于 DMSO 的体积差异不同为什么 不影响检测值已经被数学证明了 在此我不多说 如果有人不明白我再证明给他看 当然 为了养成良好的实验习惯 DMSO 的体积还是一致的好 5 检测 MTT 还原的 MTT 在 460 630 均有较好的吸收 如果你的酶标仪是滤光片 可以选 470 nm 左右或 630 nm 左右的滤光片 如果酶标仪有单波长 你可以在检测前扫描一下吸收谱 选用最大 细说波长检测就是了 最大波长 大概在 550nm 附近 必要时加一个参比波长以扣除非特 异性吸收 精品文档 11欢迎下载 6 吸收值分析 在理想的 MTT 实验中 如果是细胞抑制实验 不加药物处理组的吸收值应该在 0 8 1 2 左 右 太小检测误差占的比例较多 太大吸收值可能已经超出线性范围 这个原理在朗伯 比 尔定律中有解释 7 如果你觉得 MTT 中出现的问题不好解决 那么建议你做 CCK 8 实验 原理与 MTT 相似 但操作上简化些 当然 费用也稍微高一些 请问在做 MTT 实验室是否遇到过下面的情况 调零孔我用的培养基 在加 MTT 孵育 4 小时 后 溶液颜色没有发生太大变化 为黄色 吸取溶液加入 DMSO 之后 溶液为粉红色 并不 是无色 而且在 490nm 下的吸收值为 0 2 左右 我感觉挺大的 而加药组的最高浓度还不 如调零孔的大 如果把调零孔的值减掉之后 OD 值为负值 另外加药组加 MTT4 小时之后 溶液颜色有些发红 对照组测出的 OD 值在 0 4 0 5 之间 接种体积为 100ul 5000cells well 第一天接种 第二天加药 第三天测 mtt 波长 490nm 我做了 很多次 每次的调零孔都那样 我想不是污染 而且也没污染的迹象 我怀疑时培养基的 问题 而且我做过两次测试 一组只加含血清的培养基 一组为不加血清的培养基 其它 孔接种细胞 细胞浓度分别为 10000cells well 5000cells well 2500cells well 这 两次的结果 三个浓度下的 OD 值两次的都比较吻合 但加含血清培养基的和只加培养基的 孔的 OD 值还是很高 应当还在 0 2 左右 不知是什么原因 请分析 另外 你所给出的值 是不是在 570nm 下测的 我感觉在 490nm 下不会那么高吧 而且你复孔之间的差值一般是 多少 不好意思 你说的现象我没出现过 还得注意几点 1 MTT 应该新鲜配制 在 4 度保存最多不能超过 2 周 也有说 10 天的 反正不能太久 2 如果你养细胞的时间长 中途不换液 96 孔板周边的孔是不能用的 应该加入无菌 PBS 3 如果有心 你可以在 700 nm 做一个参比吸收 将每个孔的检测吸收减掉参比吸收后再 分析 4 加入 DMSO 之前应尽可能将培养液弃除干净 问 96 孔板里的细胞长的好象没有在培养瓶里的好 有的时候都无法判断板里细胞的死活 了 不知道有没有什么办法 丁香网友 chinaefulle 认为 1 对于贴壁细胞 死细胞呈圆形 贴壁差 活细胞 呈伸展状 贴壁好 2 对于悬浮细胞似乎不好直接判断 有一个经典方法 就是用台 盼蓝染色 细胞染上色的就是死细胞 然不上的就是活细胞 染色很快 一分钟内就可以 判断 原因是活细胞的细胞膜完整 而且有什么外排机制 不易着色 如果 96 孔板养不 好 可以试着用 24 孔板 如果是旧板养不好 就试着用新板 为了将旧板洗干净 旧板可 以下硫酸洗液 2 3 h 但不要太长 否则板就黄了 还有一点 旧板的细胞培养时贴壁较 差 可以铺多聚赖氨酸试试 如果你的细胞不好养 尽量不要用旧板 问 加 MTT 孵育 4 小时后 溶液颜色没有发生太大变化 为黄色 我想请问一下 你的 精品文档 12欢迎下载 MTT 是用无血清培养基配的吗 因为我有一次就是加错了 用正常的含血清培养基配了 结果颜色就不对了 干扰了 MTT 的检测 丁香网友 chinaefulle 认为 MTT 为淡黄色 用 0 1 M 的 PBS 配制 浓度为 5mg ml 配好 后直接取 20 ul 加入到完全培养的细胞孔中 总体积在 200 ul 左右 MTT 的体积占总体积 10 就行了 不要用培养基配制 更不要加血清 因为不要用培养基配制 更不要加血清 因为 MTTMTT 的稳定性不太好 的稳定性不太好 溶液越复杂 就可能导致溶液越复杂 就可能导致 MTTMTT 越不稳定 越不稳定 问 我也做了很长时间的 MTT 实验 一直用的是 570nm 和您说的波长所测值会有很大差 异吗 丁香网友 chinaefulle 认为 如果酶标仪用的是滤光片 那就没啥选择性 570nm 的吸收 也是挺高的 波长不同吸光度会有差异 但不影响检测结果的趋势变化 如果你用的酶标 仪有单波长 三棱镜或光栅衍射产生的 那么选用最大吸收波长有利于减少非特异性吸收 所导致的误差 问 我在的实验室做 MTT 实验所用的波长是双波 630 和 470 实验室的酶标仪没有 570 不知单波和双波有何区别 丁香网友 chinaefulle 认为 单波长也是可以用的 双波长主要可以扣除非特异性吸收 比如细胞颗粒造成的吸收和板孔背景导致的非均一性吸收 如果使用 96 孔板前先检测板孔 的背景吸收在 0 05 以下 或高于 0 05 的孔标记最好不用 单波长也能大体扣除因此造成 的非特异吸收 对于细胞造成的非特异吸收 细胞数越多 这方面的吸收也越高 对结果 判断的方向性不会有太大影响 下图 A 是氧化型 MTT 的吸收曲线 B 图是还原型的 MTT 吸 收曲线 对于你的酶标仪建议使用 470 nm 问 MTT 用 PBS 配制 原先培养基中 10 FBS 会影响结果吗 丁香网友 chinaefulle 认为 不会 因为上清会弃去 每一个孔中都平行有 10 FBS 即使 有影响 其影响的大小也是可以通过阴性对照扣除掉 精品文档 13欢迎下载 问 我一直在想一个问题 为什么网上见的 protocol 绝大部分都是 MTT 加 10 20ul 然 后放 3 4h 再测 是为了节省试剂 我想在某种程度上时间能更重要些 但为什么不增加 MTT 的量 减少孵育时间呢 从我的实验来看 增加 MTT 降低孵育时间是可行的 但是现 在也存在一个问题 就是即使用到 5000 well 现在不加药的孔的 OD 也能到 1 5 甚至 2 以 上 是否有 MTT 增加的原因 这个还在进行验证 希望有我这种实验经历和想法同行一起 讨论 丁香网友 chinaefulle 认为 你提的这个问题很好 值得探索 但是目前都是约定加入 10 体 积的 MTT 然后反应 3 4h 我个人猜想可能与以下原因有关 纯属猜测 因为没做过实验 1 根据我的经验 MTT 的溶解度不是太好 所以 0 5 的 MTT 母液 相当于 10X 已经可能 接近最大溶解极限 而直接用含血清的培养液配制因为带入的成分复杂 MTT 保存的稳定 性可能存在疑问 所以使用孵育 3 4h 的条件 2 MTT 是琥珀酸脱氢酶的人工底物 底物浓度过高可能导致酶抑制 当然 MTT 是否有此 作用值得实验验证 但大多数酶的底物浓度过高时会产生酶的抑制作用 直接的抑制作用 问 我的 MTT 是用 PBS 配的 5mg ml 因为每孔的溶液量为 100ul 所以我加了 10ul 现 在我的调零孔孵育 4 小时后为黄色 但是加入 DMSO 之后 还是红色的 490nm 下的吸收值 为 0 2 左右