荧光定量PCR实验指南(一)

荧光定量 PCR 实验指南 一 一 基本步骤 1 目的基因 DNA 和 mRNA 的查找和比对 2 引物 探针的设计 3 引物探针的合成 4 反应体系的配制 5 反应条件的设定 6 反应体系和条件的优化 7 荧光曲线和数据分析 8 标准品的制备 二 技术关键 1 目的基因 DNA 和 mRNA 的查找和比对 从 http www ncbi nlm nih gov 网点的 genbank 中下载所需要的序列 下载的方式有 两种 一为打开某个序列后 直接点击 save 保存格式为 txt 文件 保存的名称 中要包括序列的物种 序列的亚型 序列的注册号 然后 再打开 DNAstar 软件中的 Editseq 软件 点击 file 菜单中的 import 打开后点击 save 保存为 seq 文件 另一种直接用 DNAstar 软件中的 Editseq 软件 点击 file 菜单中的 open entrez sequence 导入后保存为 seq 文件 保存的名称中要包括序列的物种 序 列的亚型 序列的注册号 然后要对所有的序列进行排序 用 DNAstar 软件中的 Seqman 软件 点击 sequence 菜单中的 add 选择要比较的 seq 的所有文件 点击 add 或 add all 然后点击 Done 导入要比较的序列 再点击 assemble 进行比较 横线的上列为一致性序列 所有红色的碱基是不同的序列 一致 的序列用黑色碱基表示 有时要设定比较序列的开始与结尾 有时因为参数设置的原因 可能分为几组 contig 若想全部放在一组中进行比较 就调整 project 菜单下的 parameter 在 assembling 内的 minimum math percentage 默认设置为 80 可调低即可 再选择几个组 点击 contig 菜单下的 reassemble contig 即可 选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个 contig 内的前提下 尽量提高 minimum math percentage 的值 有时因此个别序列原因 会出现重复序列 碱基 的缺失或插入 要对 contig 的序列的排列进行修改 确保排列是每个序列的真实且排 列同源性最好的排列 然后 点击 save 保存即可 分析时 主要是观察是否全部为一 致性的黑色或红色 对于弥散性的红色是不可用的 2 引物和探针设计 2 1 引物设计 细心地进行引物设计是 PCR 中最重要的一步 理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列 而非其他序列退火 设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列 下面的指导描述了 一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点 序列选取应在基因的保守区段 扩增片段长度根据技术的不同有所分别 sybr green I 技术对片段长度没有特殊要求 Taqman 探针技术要求片段长度在 50bp 150bp 避免引物自身或与引物之间形成 4 个或 4 个以上连续配对 避免引物自身形成环状发卡结构 典型的引物 18 到 24 个核苷长 引物需要足够长 保证序列独特性 并降低序列存在于 非目的序列位点的可能性 但是长度大于 24 核苷的引物并不意味着更高的特异性 较长 的序列可能会与错误配对序列杂交 降低了特异性 而且比短序列杂交慢 从而降低了产 量 Tm 值在 55 65 GC 含量在 40 60 引物之间的 TM 相差避免超过 2 引物的 3 端避免使用碱基 A 引物的 3 端避免出现 3 个或 3 个以上连续相同的碱基 为避免基因组的扩增 引物设计最好能跨两个外显子 2 2 Taqman 探针设计 一般设计原则 探针位置尽可能地靠近上游引物 探针长度通常在 25 35bp Tm 值在 65 70 通常比引物 TM 高 5 10 GC 含 量在 40 70 探针的 5 端应避免使用碱基 G 整条探针中 碱基 C 的含量要明显高于 G 的含量 为确保引物探针的特异性 最好将设计好的序列在 blast 中核实一次 如果发现有非特 异性互补区 建议重新设计引物探针 www ncbi nlm nih gov BLAST 2 3 Taqman MGB 探针设计介绍 MGB 探针的优点 MGB 探针较短 14 20bp 更容易找到所有排序序列的较短片段的保守区 短片段探针 14 20bp 加上 MGB 后 Tm 值将提高 10 更容易达到荧光探针 Tm 值 的要求 MGB 探针的设计原则 探针的 5 端避免出现 G 即使探针水解为单个碱基 与报告基团相相连的 G 碱基仍可 淬灭基团的荧光信号 用 primerexpress 软件评价 Tm 值 Tm 值应为 65 67 尽量缩短 Taqman MGB 探针 但探针长度不少于 13bp 尽量避免出现重复的碱基 尤其是 G 碱基 应避免出现 4 个或 4 个以上的 G 重复出现 原则上 MGB 探针只要有一个碱基突变 MGB 探针就会检测到 MGB 探针将不会与目 的片段杂交 不产生荧光信号 因此 在进行 SNP 检测时 为了检测到突变子 即 Taqman MGB 不与目的片段杂交 不产生荧光信号 探针目的片段产生荧光信号检测将 探针的突变位点尽量放在中间 1 3 的地方 注意 为了满足上述要求的 4 个条件 探针的 突变位点可向 3 端移动 但突变位点至少在离 3 端 2 个碱基的前方 即必须确保探针的 后两个碱基是绝对的保守 以进行 SNP 检测 反过来 若要进行同类检测 找的是保守 片段区 探针中不应有突变位点 若探针即便是只有 13 个 bp 探针仍不完全保守 有几个 突变 突变位点也应靠近探针的 5 端 这样 即便是突变 探针也可与目的片段杂交 产生荧光信号 另一种方法是设计简并探针 也可达到即使是突变 仍可检测到突变 2 4 实时多重 PCR 探针的选择 多重实时 PCR 的多种含意有两种 一为选择保守的探针和引物 利用不同的染料标记探针 在检测时可根据荧光的颜色来判定不同的产物 另一种为选择保守的引物 扩增不同长度 的目的片段 反应中加入 SYBRN 染料 最后根据不同目的片段的 Tm 值来判定不同的物 品 多重实时 PCR 的荧光探针应为同一类型 如同时为 Taqman 探针 或同时为 MGB 探针 或同时为 Beacon 探针 在多重 PCR 中 多重 PCR 的各个引物之间相互干扰和各个探针之间相互干扰分析 设计好各对引物和探针后 重新在用 DNAstar 软件中的 Primerselect 软件 打开保守在 同一文件中的多重 PCR 的引物文件 然后两两分别选中所设计的多重引物或两两分别选中 所设计的多重探针后 在 report 菜单下 primer pair dimers 分析上下游引物的 dimers 弹出的窗口中就告诉此对引物有多少个 dimer 并对此对引物用 dG 值进行评价 通常给出最差的 dG 值 理论上是 dG 值越大越好 3 影响 PCR 及荧光 PCR 的其他因素 引物的设计和选择符合荧光 PCR 的探针并进行设计对于实时荧光 PCR 尤其重要 可以说 不合理的设计意味着绝对的失败 但是 好的设计并不等于好的实验结果 影响 PCR 和荧 光 PCR 的因素非常多 下面择其重要进行介绍 3 1 引物退火温度 引物的一个重要参数是熔解温度 Tm 这是当 50 的引物和互补序列表现为双链 DNA 分子时的温度 Tm 对于设定 PCR 退火温度是必需的 在理想状态下 退火温度足够低 以保证引物同目的序列有效退火 同时还要足够高 以减少非特异性结合 合理的退火温 度从 55 到 70 退火温度一般设定比引物的 Tm 低 5 设定 Tm 有几种公式 确定引物 Tm 最可信的方法是近邻分析法 大部分计算机程序使用 近邻分析法 从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性 所有 oligo 软 件会自动计算引物的 Tm 值 在设置退火温度时可以如下进行 以低于估算的 Tm5 作为 起始的退火温度 以 2 为增量 逐步提高退火温度 较高的退火温度会减少引物二聚体 和非特异性产物的形成 为获得最佳结果 两个引物应具有近似的 Tm 值 引物对的 Tm 差异如果超过 5 就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始 如 果两个引物 Tm 不同 将退火温度设定为比最低的 Tm 低 5 或者为了提高特异性 可 以在根据较高 Tm 设计的退火温度先进行 5 个循环 然后再根据较低 Tm 设计的退火温度 进行剩余的循环 这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝 3 2 引物浓度 引物的浓度会影响特异性 最佳的引物浓度一般在 0 1 到 0 5 M 较高的引物浓度会导致 非特异性产物扩增 为了确定引物浓度 可以在 260nm OD260 测量光密度值 然后 使用光吸收值和微摩消光系数的倒数 nmol OD 通过 Beers 法则 公式 1 计算引物 浓度 微摩消光系数可以使用公式 2 计算 与大分子双链 DNA 可以使用平均消光系数不 同 确定引物的精确浓度必须使用计算的消光系数 这是因为引物较短 碱基组成差异很 大 在 oligo 软件上可以计算出引物的的消光系数 OD mol 和消光系数的倒数 mol OD 一般商业合成的引物以 O D 值表示量的多少 在一般情况下 20 个碱基长的引物 1 个 O D 加 100ul 水后引物浓度为 50pmol ul 50 M 也可以用 OLIGO 软件 根据引物 的的消光系数 OD mol 计算出一定的工作浓度下 引物的加水量 浓度 M A260 OD ml 稀释系数 消光系数的倒数 nmol OD 举例 计算某寡核苷酸 溶于 1ml 水中 取其中的 10 l 稀释 100 倍 加入 990 l 水 中 在 A260 处测吸光度为 0 2 计算消光系数的倒数为 4 8 nmol OD 代入得 浓度 0 2 OD ml 100 4 8 nmol OD 96nmol ml 96 M 3 3 引物 探针的纯度和稳定性 定制引物的标准纯度对于大多数 PCR 应用是足够的 部分应用需要纯化 以除去在合成过 程中的任何非全长序列 这些截断序列的产生是因为 DNA 合成化学的效率不是 100 这是个循环过程 在每个碱基加入时使用重复化学反应 使 DNA 从 3 到 5 合成 在任何 一个循环都可能失败 较长的引物 尤其是大于 50 个碱基 截断序列的比例很大 可能 需要纯化 引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响 定制引物以干粉形式运输 最好在 TE 重 溶引物 使其最终浓度为 100 M 也可以用双蒸水溶解 引物的稳定性依赖于储存条件 应将干粉和溶解的引物储存在 20 以大于 10 M 浓度 溶于 TE 的引物在 20 可以稳定保存 6 个月 但在室温 15 到 30 仅能保存不到 1 周 干粉引物可以在 20 保存至少 1 年 在室温 15 到 30 最多可以保存 2 个月 探针即寡核苷酸进行荧光基团的标记 标记本身有效率的区别 探针标记以后一般应该纯 化 纯度高 标记效率高的探针不仅荧光值高 且保存时间可以高达一年以上 不同的生 物技术公司探针标记效率和纯度有很大的区别 由于反复冻融易导致探针降解 在确认探针质量好的情况下 最好稀释成 2uM 10 作为工作浓度分装多支 避光保存 3 4 热启动 热启动 PCR 是除了好的引物设计之外 提高 PCR 特异性最重要的方法之一 尽管 Taq DNA 聚合酶的最佳延伸温度在 72 聚合酶在室温仍然有活性 因此 在进行 PCR 反应 配制过程中 以及在热循环刚开始 保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物 这 些非特异性产物一旦形成 就会被有效扩增 在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位 而受限时 如定点突变 表达克隆或用于 DNA 工程的遗传元件的构建和操作 热启动 PCR 尤为有效 限制 Taq DNA 聚合酶活性的常用方法是在冰上配制 PCR 反应液 并将其置于预热的 PCR 仪 这种方法简单便宜 但并不能完全抑制酶的活性 因此并不能完全消除非特异性产物 的扩增 热启动通过抑制一种基本成分延迟 DNA 合成 直到 PCR 仪达到变性温度 包括延缓加入 Taq DNA 聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐 尤其是对高通量应用 其他的 热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分 如镁离子或酶 包裹起来 或者将反应成分 如模板和缓冲液 物理地隔离开 在热循环时 因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在 一起 象手动热启动方法一样 蜡防护层法比较烦琐 易于污染 不适用于于高通量应用 Transitor Hot Start Taq 酶对于自动热启动 PCR 来说高效可靠 Transitor Hot Start Taq 是在常规 Taq 酶的基础上进行了化学修饰 使得该酶在低温或常温下没有酶活 因此 在加样至 PCR 扩增前 不会产生由于引物随机粘连而形成的非特异性扩增 高温条件下 化学修饰集团会被剪切 从而释放酶活 此外 随着 PCR 扩增的进行 酶活会被逐步释放 有效提高扩增效率及产物量 Transitor Hot Start Taq DNA 聚合酶在变性步骤的 95 保温过程中要持续 20 分钟才会被释放到反应中 从而完全恢复聚合酶活性 3 5 镁离子浓度 镁离子影响 PCR 的多个方面 如 DNA 聚合酶的活性 这会影响产量 再如引物退火 这 会影响特异性 dNTP 和模板同镁离子结合 降低了酶活性所需要的游离镁离子的量 最 佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同 但是包含 200 M dNTP 的实时定量 PCR 使用 3 到 5mM 带有荧光探针的镁离子溶液 普通 PCR 是 1 5mM 较高的游离 镁离子浓度可以增加产量 但也会增加非特异性扩增 降低忠实性 为了确定最佳浓度 普通 PCR 从 1mM 到 3mM 以 0 5mM 递增 进行镁离子滴定 为减少对镁离子优化的 依赖 可以使用 Transitor Hot Start Taq 酶 Transitor Hot Start Taq DNA 聚合酶 能够在比一般的 Taq DNA 聚合酶更广的镁离子浓度范围内保持功能 因此仅需较少的优 化 3 6 模板质量 模板的质量会影响产量 DNA 样品中发现有多种污染物会抑制 PCR 一些在标准基因组 DNA 制备中使用的试剂 如 SDS 在浓度低至 0 01 时就会抑制扩增反应 分离基因组 DNA 较新的方法包括了 DNAZol 一种胍去垢剂裂解液 以及 FTA Gene Guard System 其可以同基质结合 在血液及其他生物样品中纯化贮存 DNA 应注意进行 PCR 反应的模板质量 以增加 PCR 反应的成功率 3 7 模板浓度 起始模板的量对于获得高产量很重要 对大多数 PCR 扩增和荧光 PCR 扩增 104 到 106 个起始目的分子就足以观测到好的荧光曲线 或在溴化乙锭染色胶上观察到 所需的最 佳模板量取决于基因组的大小 下表 举例说 100ng 到 1 g 的人类基因组 DNA 相 当于 3 104 到 3 105 个分子 足以检测到单拷贝基因的 PCR 产物 质粒 DNA 比较小 因此加入到 PCR 中的 DNA 的量是 pg 级的 对于一般的检测样品 10 100ng 的量就足 够检测了 当然对模板做一个梯度稀释 对于定量 PCR 而言是非常容易 且能分析扩增效 率 表 1 基因组大小和分子数目的比例 基因组 DNA Size bp Target Molecules g of Genomic DNA Amount of DNA g for 10 5 Molecules E coli 4 7 10 6 1 8 10 8 0 001 Saccharomyces cerevisiae 2 0 10 7 4 5 10 7 0 01 Arabidopsis thaliana 7 0 10 7 1 3 10 7 0 01 Drosophila melanogaster 1 6 10 8 6 6 10 5 0 5 Homo sapiens 2 8 10 9 3 2 10 5 1 0 Xenopus laevis 2 9 10 9 3 1 10 5 1 0 1 0Mus musculus 3 3 10 9 2 7 10 5 1 0 Zea mays 1 5 10 10 6 0 10 4 2 0 pUC 18 plasmid DNA 2 69 10 3 3 4 10 11 1 10 6 3 8 防止残余 Carry over 污染 PCR 易受污染的影响 因为它是一种敏感的扩增技术 小量的外源 DNA 污染可以与目的 模板一块被扩增 当前一次扩增产物用来进行新的扩增反应时 会发生共同来源的污染 这称之为残余污染 从其他样品中纯化的 DNA 或克隆的 DNA 也会是污染源 非残余污 染 可以在 PCR 过程中使用良好的实验步骤减少残余污染 使用带滤芯的移液管可以阻止气雾 剂进入 eppendorf 管内 为 PCR 样品配制和扩增后分析设计隔离的区域 在准备新反应 前更换手套 总是使用不含有模板的阴性对照检测污染 使用预先混合的反应成分 而不是每个反应的每个试剂单独加入 一种防止残余污染的方法是使用尿嘧啶 DNA 糖基化酶 UDG 这种酶 也称为尿嘧啶 N 糖基化酶或 UNG 移除 DNA 中的尿嘧啶 在扩增过程中将脱氧尿嘧啶替换为胸腺嘧 啶使得可以把前面的扩增产物同模板 DNA 区分开来 因为前面的扩增产物对 UDG 敏感 所有可以在 PCR 前对新配制的反应用 UDG 处理以破坏残余产物 荧光定量 PCR 实验指南 二 1 高产量 特异和灵活的定量 PCR 试剂体系 影响 PCR 的因素如此之多 您有时很难区分是什么导致您的实验结果不佳 降低实验的不 稳定因素是使用优质可靠的产品 使用优质 性能可靠的热启动酶 优质的 dNTP Mg 离子 UNG dUTP 防污染系统预混 成的定量 PCR 试剂体系 最大程度的降低了反应变量 提高了实验的可重复性和可靠性 您还需要进行以下步骤的准备 设计引物和探针 合成引物和探针 正确储藏 得到高质 量的模板 随后 您仅需要进行退火温度的优化 就能得到好的实验结果 FQ PCR MASTER Mix UDG hot start 同竞争对手的定量 PCR 体系相比提供了更优异 的结果 使用这种产品 您可以在您的 PCR 中得到更好特异性和更高的灵敏度 同时可以 灵活地选择您所喜欢的扩增条件 检测方法和设备 实时定量 PCR 是快速增长的 PCR 方法 它可以精确 可重复地定量起始物质 FQ PCR MASTER Mix UDG hot start 是一种方便使用的反应混合液 为定量分析进行了优化 它包含了荧光 PCR 所必须的成分 如缓冲液 dNTP 聚合酶 只需加入您的模板 扩 增引物和荧光标记探针 您就可以得到实时 qPCR 所需的特异性和灵活性 您可以利用成套的 hot start Taq 酶 kit A2010A0106 来配制不含有 UNG dUTP 防污 染系统的热启动荧光 PCR 体系 您也可以选择 hot start Taq 酶 UNG 酶和 dNTPS 来配制含有 UNG dUTP 防污染系统 的热启动荧光 PCR 体系 您可以从实验角度得到多种选择 得到高产量 特异和灵活的定量 PCR 试剂体系 高产量和特异性的扩增 FQ PCR MASTER Mix UDG hot start 提供了强大的 PCR 扩增 可以使用多个模板组 所使用的 Taq DNA 聚合酶具有热启动特性 这极大地降低和消除了错误配对和非特异性 扩增 使您得到较高产量 并增加特异性 整合的 UDG 尿苷酸 DNA 糖基化酶 防止残 余污染的能力防止了非模板 DNA 的扩增 从而降低了假阳性 使结果更可靠 在产量和灵敏度方面 Quantitative PCR MASTER Mix UDG hot start 的灵敏度极高 阈循环 您可以更精确地定量低拷贝的基因 并在较宽的目的浓度范围内检测线性剂 量反应 高度灵活性 除了灵敏度和特异性外 Universal PCR Master Mix Kit 在分析设置 检测方法和设备上 给您提供了较高的自由度 使用 Universal PCR Master Mix Kit 您可以 对扩增的不同模板优化镁离子浓度 由于提供了附加的氯化镁 所以您可以方便地配置 Mix 体系 可以更灵活的进行普通 PCR 和荧光 PCR 可以在多种设备上使用 如 ABI Prism 7700 ABI GeneAmp 5700 和 Bio Rad 的 I Cycler 可以利用多种检测方法的优点 包括 TaqMan 探针和 Molecular Beacon 您不必局限 于特定的试剂盒 您还可以灵活的选择进行自配荧光 PCR 体系 不论是含 UNG dUTP 防污染系统还是不含 该系统的 2 反应体系配制 A2010A0101 试剂盒 探针体系 FQ PCR MasterMix UNG 混合物 2X 25ul 终浓度为 1 上游引物 终浓度为 50 900nM 可先设 200 nM 下游引物 终浓度为 50 900nM 可先设 200 nM 探针 终浓度为 200nM 待检样品 5ul 终浓度 为 10 100ng 无菌去离子水 补足 使总体积达到 50ul 您可以选择荧光染料 SYBGREEN 体系 具体请参照说明书 您可灵活使用 20 50ul 间其他体积 注意保证终浓度相同 A2010A0106 试剂盒 反应体系终浓度 自配热启动荧光系统 1 2U 的 hot start Taq 酶 3 5 5mM 的 Mg2 0 2mM 的 dNTPs 1 PCR buffer A2010A0106 50 900nM 的上游引物 可先设 200 nM 50 900nM 的下游引物 可先设 200 nM 200nM 的探针 通常取 2 5ul 的模板 无菌去离子水 补足 反应总体积通常为 20 50ul 自配热启动荧光 UNG 体系 1 2U 的 Taq 酶 1 PCR buffer 2 5 4 0mM 的 Mg2 A2010A0105 0 2 1U 的 UNG 酶 A2010A0107 可先设为 0 5U 0 2mM 的 d A C G TPs 0 2 0 4mMdUTP 要调整 A2010A0108 50 900nM 的上游引物 可先设 200 nM 50 900nM 的下游引物 可先设 200 nM 200nM 的探针 通常取 2 5ul 的模板 反 应总体积通常为 20 50ul 3 反应体系和条件的优化 使用高产量 特异和灵活的定量 PCR 试剂体系 FQ PCR MASTER Mix UDG hot start 优化参数最少 您只需要优化退火温度 就可以得到更灵敏 更可靠的定量结果 对于特 殊结构的荧光 PCR 您可以优化引物浓度 来得到更特异或更灵敏的结果 使用通用 PCR Master Mix 试剂盒进行反应体系的配制 可以适合更多的反应体系 如 mRNA 的普通 RT PCR 检测 适用于合成质粒的 PCR 同时也适用于荧光 PCR 范围更 宽 采用成套的 hot start Taq 酶 kit A2010A0106 该试剂盒中含有进行热启动荧光核心试 剂盒的所有成分 也降低了选择纯度不够或不合适产品的风险 您需要根据以下原则进行 优化 1 您需要对酶量和镁离子浓度进行优化 酶的推荐反应浓度为 1 25 1 5 U 50ul 必要时可在 1 2U 之间探讨酶的最佳条件 Mg 离子推荐浓度普通 PCR 终浓度为 1 3 mM 荧光 PCR 终浓度为 3 5 5 mM 请在该范围内探讨最佳条件 2 试剂盒中提供的 dNTP 已经预混 能够充分保证产品质量和 PCR 的忠实性 dNTP 选 择经典的 0 2mM 的浓度即可 3 另外 上游引物和下游引物浓度可先设为 200 nM 当结果不理想时 可以在 50nM 900nM 之间进行探讨 4 如选用 Taqman 探针 探针浓度可设为 200 nM 不须探讨 选择其他种类的探针需 根据要求设置探针浓度 5 可以先用推荐的反应条件 如果结果不佳 可根据引物 探针设计的具体情况适合的 退火温度 退火时间和循环数 6 DNA 模板的添加量通常在 100 ng 以下 因不同种类的 DNA 模板中含有的靶基因的 拷贝数不同 必要时可进行梯度稀释 确定最佳的 DNA 模板添加量 如果欲进行 2 Step RT PCR 反应