齐江华硕士论文

分类号 R6 单位代码 10752 密 级 公 开 学 号 2008091 宁夏医科大学宁夏医科大学 硕士研究生学位论文硕士研究生学位论文 DBS 治疗对癫痫大鼠海马电生理及突触外 GABA 受体分布与表达的影响 Effects of DBS Treatment on Electrophysiological Changes of Hippocampus and Expression of the Extrasynaptic GABA Receptor in Epileptic Rats 学 位 申 请 人 齐江华 指导教师 孙涛 教授 申请学位门类级 别 医学 专业名称 神经外科 研究方向 癫痫的基础与临床研究 所在学院 临床学院 论 文 完 成 日 期 二 一一年四月 宁夏医科大学研究生学院 Ningxia Medical University Thesis for Application of Master s Degree Effects of DBS Treatment on Electrophysiological Changes of Hippocampus and Expression of the Extrasynaptic GABA Receptor in Epileptic Rats Student s Name Qi Jianghua Supervisor Pro Sun Tao Assistant supervisor Subject Category Major Specialty School Completion Date April 2011 宁夏医科大学学位论文独创性声明宁夏医科大学学位论文独创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是个人在导师的指导下 独立进 行研究工作所取得的成果 无抄袭及编造行为 除文中已经特别加以注明 引用的内容外 本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品 成果 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体 均已在文中以明确方式 标明并致谢 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担 论文作者签名 论文导师签名 年 月 日 年 月 日 宁夏医科大学关于学位论文使用授权的声明宁夏医科大学关于学位论文使用授权的声明 宁夏医科大学有权保留使用本人学位论文 同意学校按规定向国家有 关部门机构送交论文的复印件和电子版 允许被查阅和借阅 本人授权宁 夏医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文 可以公布 包括刊登 论文的全部或部分内容 保密论文在解密后应遵守此规定 论文作者签名 论文导师签名 年 月 日 年 月 日 宁夏医科大学硕士论文 摘要 I DBS 治疗对癫痫大鼠海马电生理及突触外治疗对癫痫大鼠海马电生理及突触外 GABA 受体分布与表达的影响受体分布与表达的影响 摘摘 要要 目的目的 探讨丘脑底核深部脑电刺激治疗对海人酸癫痫大鼠模型海马区域电生理模式 及突触外 GABA 受体 亚基分布与表达的影响 方法方法 SD 大鼠 24 只 随机分为正常对照组 癫痫组和 DBS 治疗组 每组 8 只 利用立体定位仪在大鼠海马植入注药套管并在海马及丘脑底核安装记录及刺激电极 在自由状态下经注药套管注射海人酸 建立海人酸癫痫大鼠模型 采用高频电刺激对 治疗组大鼠进行 DBS 治疗 观察动物行为学变化 通过 Alpha Omega 脑电信号采集系 统记录大鼠癫痫发作及治疗过程中海马区域脑电信号 利用 NeuroExplorer 软件对脑电 信号进行时域及频域分析 观察 DBS 治疗对海马电生理模式的影响 DBS 治疗 10d 后 取各组大鼠脑组织 经 Nissl 染色观察大鼠海马神经元的变化 同时利用免疫组织化学 染色技术检测大鼠脑组织中突触外 GABA 受体 亚基在癫痫发生时及 DBS 治疗后的分 布与表达 结果结果 1 正常对照组大鼠未见癫痫发作 DBS 治疗组大鼠癫痫发作次数 6 01 4 87 n 8 明显低于癫痫对照 17 31 4 59 n 8 p 0 05 2 癫痫大鼠海马异常放电信号中的高频部分和低频部分分别在 DBS 治疗的早期和 晚期被抑制 但 DBS 治疗并没有改变海马神经元 spike 频率 3 Nissl 染色结果显示 DBS 治疗组 463 62 38 41 n 8 大鼠海马神经元坏死及 胶质细胞增生程度较癫痫组轻 357 12 20 50 n 8 P 0 05 4 免疫组织化学染色结果显示 正常对照组大鼠脑组织突触外 GABA 受体 亚基 主要分布在海马 IOD 30 96 2 73 n 8 与丘脑腹外侧核 IOD 32 85 2 35 n 8 癫痫组大鼠脑组织海马 IOD 12 31 1 72 n 8 及丘脑腹外侧核 IOD 22 39 1 94 n 8 突触外 GABA 受体 亚基表达下降 DBS 治疗组的丘脑腹 宁夏医科大学硕士论文 摘要 II 外侧核 IOD 35 91 3 97 n 8 突触外 GABA 受体 亚基与正常对照组相比较表达增 强 P 0 05 海马区 IOD 22 74 2 08 n 8 突触外 GABA 受体 亚基表达低于正 常对照组 P 0 05 但是比癫痫组表达增高 P 0 05 结论结论 丘脑底核 DBS 治疗可以通过改变大脑突触外 GABA 受体 亚基的分布与表 达 抑制癫痫大鼠海马的异常放电 抑制癫痫大鼠海马神经元病理变化 起到对癫痫 的治疗作用 关键词关键词 癫痫 海马 丘脑底核 深部脑电刺激 海人酸 突触外 GABA 受体 宁夏医科大学硕士论文 英文摘要 III Effects of DBS Treatment on Electrophysiological Changes of Hippocampus and Expression of the Extrasynaptic GABA Receptor in Epileptic Rats ABSTRACT Objective To approach the effectiveness of STN DBS treatment on electrophysiology cal changes of hippocampus and the distribution and expression of the delta subunit of the GABAA receptor in the kainic acid induced rat model Methods SD rats n 24 male were randomized into the blank control group epilepsy group and DBS treatment group Implanted the injection tube in the hippocampus and recording and stimulating electrodes in the subthalamic nucleus by stereotaxic apparatus established the kainate rat model of epilepsy in the free state given the high frequency electrical stimulation to the treatment group for DBS therapy we observed the changes in animal behavior The neuron electrophysiological signal of rats in the hippocampus were recorded by the Alpha Omega EEG signal acquisition system during the seizures and after the DBS analysis the time domain and frequency domain of the EEG signal by the NeuroExplorer software observed the hippocampal physiology pattern by DBS treatment Given 10 days DBS treatment all the rats brain tissue was obtained to observer the DBS treatment effects on the epileptic hippocampal neurons by Nissl staining while use of immunohistochemistry to detect the distribution and expression of subunit containing extrasynaptic GABA receptor in the seizure states and the DBS treatments Result 1 There was no seizures in the normal control group The seizure frequency in the DBS treatment group 6 01 4 87 n 8 was significantly lower than the epilepsy control group 17 31 4 59 n 8 p 0 05 宁夏医科大学硕士论文 英文摘要 IV 2 Both the low and high frequency components of the abnormal discharge were inhibited in the earlier and later stages respectively in the hippocampus of epileptic rat However DBS treatment does not change the spike frequency of the hippocampal neurons 3 Nissl staining showed that hyperplasia of hippocampal neurons loss and glial cells in the STN DBS treatment group 463 62 38 41 n 8 lighter than the epilepsy group 357 12 20 50 n 8 P 0 05 4 Compared with the blank control group IOD 30 96 2 73 in hippocampus and IOD 32 85 2 35 in thalamencephal and the epilepsy control group IOD 12 31 1 72 in hippocampus and IOD 22 39 1 94 in thalamencephal the immunohistochemistry results showed that DBS induced a significant increase of the expression of the delta subunit of the GABAA receptor in the thalamencephal IOD 35 91 3 97 P 0 05 while inhibited the decrease of the delta subunit of the GABAA receptor in hippocampus IOD 22 74 2 08 P 0 05 Conclusion STN DBS treatment can inhibit the epilepsy and alter the electrophysiolo gical patter of Hippocampus by increasing the expression of the delta subunit of the GABAA receptor in the thalamencephal and hippocampus Key words epilepsy hippocampus STN DBS kainic acid extrasynaptic GABA receptor 宁夏医科大学硕士论文 英文摘要 V 宁夏医科大学硕士论文 中英文缩略词表 VI 中英文缩略词表中英文缩略词表 英文简称 英文全称 中文全称 DBS deep brain stimulation 深部脑电刺激 ddH2O Deionized water 去离子水 EEG electroencephalograph 脑电图 EP Epilepsy 癫痫 ICH Immunohistochemistry 免疫组织化学染色 IOD integrating optical density 积分光密度值 KA kainic acid 海人酸 LFP local field potential 局部场电位 PSD power spectrum density 功率谱密度 STN subthalamic nucleus 丘脑底核 宁夏医科大学硕士论文 目录 VII 目目 录录 前言 1 材料与方法 4 结果 10 讨论 13 结论 18 附图 19 参考文献 25 文献综述 30 综述参考文献 36 宁夏医科大学硕士论文 前言 1 前前 言言 癫痫 epilepsy EP 是一种临床上较为常见的疾病 全世界约有 5 千万患者 1 每年 新增的患者中 约 30 的癫痫起源于大脑颞叶皮质 2 且这些颞叶癫痫患者中约 25 不能通过抗癫痫药物控制 为难治性癫痫 3 因此 研究颞叶癫痫治疗的意义非常重大 目前国内外研究颞叶癫痫的手段很多 其中利用癫痫动物模型模拟临床癫痫患者 来研究癫痫的发病病因 机制及治疗的方法得到了诸多研究者的认同 在此研究过程 中 已经发现了多种制作颞叶癫痫模型的动物和方法 海人酸模型是应用广泛的一种 癫痫动物点燃模型 全身或局部给予致癫剂量的海人酸 可与脑组织中谷氨酸 天冬 氨酸能神经末梢突触前膜的海人酸受体结合 产生突触后电位 选择性激活边缘系统 引起急性癫痫发作 由于海人酸的神经兴奋性毒性可造成海马神经元广泛的损伤 导 致急性癫痫发作后出现一个静止期 之后海马神经元表现为坏死 神经纤维增生以及 苔藓纤维发芽 4 出现反复慢性发作 一方面 这种病理变化可导致海马区域神经元兴奋性异常增高 最直接的表现就 是海马电生理模式的改变 5 传统的脑电图记录 electroencephalograph EEG 显示海 马区域同步化异常放电 出现节律性尖波及棘慢复合波等特征性癫痫波 6 随着脑电生 理实验技术的发展 对局部细胞外脑电记录研究表明 海马区脑电信号局部场电位 local field potential LFP 及神经元单细胞 spike 等放电模式都有改变 7 LFP 和 spike 是现代电生理研究较常用的观测指标 前者是记录电极局部范围神经元簇神经放 电叠加在时间序列上的电势 反应了记录电极局部区域的整体神经元的兴奋性和活动 后者是单细胞神经元的神经放电 反应了单个或者一类神经元的电生理特征 对 LFP 和 spike 的研究更深入的揭示了神经的电生理功能 8 另一方面 癫痫异常放电可以引起大脑广泛的神经生物学变化 9 这种变化主要表 现在兴奋性神经递质与抑制性神经递质平衡的破坏 同时也表现在神经递质受体的分 布与表达的异常改变 10 近年 突触外 GABA 受体在癫痫的发病中逐渐受到人们的关 宁夏医科大学硕士论文 前言 2 注 11 突触外 GABA 受体是一种特殊的抑制性受体 由突触外低浓度 GABA 介导产 生一个持续的张力性抑制从而起到调节神经元兴奋性的作用 12 突触外 GABA 张力性 抑制广泛存在于中枢神经系统中的主要型和中间型神经元中 如小脑 皮层 海马 下丘脑和脊髓 13 目前认为它在调节神经网络兴奋性 信息处理 认知和记忆中都起 到极其重要的作用 14 突触外 GABA 受体的组成 生物物理学和药理学特性不同于传 统的突触 GABA 受体 一个显著特点是突触外 GABA 受体包含 5 亚单位和 亚基 15 16 其中 亚基的功能比较复杂 在神经系统的多种调节中都有涉及 17 研究表明 突触外 GABA 受体调节张力性抑制与癫痫的调节有着密切的关 18 19 在动物模型和颞 叶癫痫患者中均发生了多种 GABA 受体亚基的改变 这些改变不仅包括 GABA 受体亚 单位表达的上调和下 而且包括表达部位的改变 同时也包括修饰受体的亚基组合 20 研究发现 癫痫可以诱导突触外 GABA 受体 亚基的分布与表达的变化 且和癫痫的 耐药性相关 21 22 癫痫的发病涉及多种因素 23 24 治疗方法也多种多样 25 近年来 DBS 对癫痫治 疗的良好效果引起了研究者广泛的关注 逐渐成为了治疗癫痫的新途径 26 深部脑刺 激 deep brain stimulation DBS 是指通过立体定向方法进行精确定位 在脑内特定的靶 点如皮层下结构 丘脑 海马 脑干等处植入微小刺激电极进行高频电刺激 从而改 变相应核团的兴奋性以达到改善中枢神经系统疾病如帕金森 癫痫等的一种安全 有 效 简单的新疗法 DBS 同时对张力障碍性震颤 疼痛 药物成瘾 严重的抑郁性障 碍 精神分裂等也有不同程度的疗效 27 28 在实验研究和临床实践中 对癫痫尤其是难治性癫痫 选择丘脑底核 STN 作为 DBS 治疗的靶点取得了较为满意的疗效 26 这种治疗方法不仅能有效抑制癫痫的发作 而且相对安全 32 但 DBS 治疗癫痫的机制存在多种假设 至今仍没有一个明确的定论 29 这一直是人们研究的热点和难点 34 丘脑底核位于基底节区中间部位 基底节区 核团之间通过抑制性连接和兴奋性连接构成一个复杂的神经网络 进入这个神经网络 的信号主要来自大脑皮层和丘脑 而输出信号直接通过丘脑 脑干等区域作用于大脑 皮层 30 给予丘脑底核电刺激可以同时产生局部效应和远隔效应 一方面 丘脑底核 宁夏医科大学硕士论文 前言 3 电刺激可以抑制刺激部位神经元的兴奋性 降低神经元放电的频率 从而减弱了丘脑 底核对大脑皮层的兴奋作用 降低大脑皮层神经的兴奋性 抑制癫痫的发作 31 另一 方面 丘脑底核 DBS 刺激可以提高下游抑制性 GABA 能神经元苍白球内侧 internal part of globus pallidus GPi 的活性 可通过这种远隔效应间接降低大脑皮质的兴奋性 减轻患者的症状 32 33 同时 大部分丘脑底核 DBS 神经化学与基因表达方面的研究支 持这一结论 为 DBS 刺激广泛改变神经网络提供进一步的证据 利用脑组织内微量透 析技术发现 正常大鼠丘脑底核高频电刺激可以显著增加黑质网状部细胞外 GABA 的 分泌 也有研究报道 丘脑底核 DBS 可以降低 c Fos c Jun 和 Krox 24 等即早基因的 表达 34 丘脑底核 DBS 治疗能否抑制海马神经元的兴奋性 能否调节海马神经元异常的放 电模式 丘脑底核 DBS 治疗是否通过改变癫痫大鼠大脑突触外 GABA 受体 亚基的分 布与表达来起到对癫痫的治疗 国内外相关研究较少 在查阅相关资料的基础上 本 研究改进了传统的海人酸大鼠癫痫模型 并给予丘脑底核高频电刺激治疗 观察丘脑 底核 DBS 治疗的效果 记录比较了癫痫的发病过程及治疗中海马区域电生理变化 采 用 Nissl 染色观察 DBS 对癫痫大鼠海马神经元的保护作用 同时利用免疫组织化学染 色方法检测海人酸癫痫大鼠 DBS 治疗下大鼠脑组织突触外 GABAA 受体 亚基的分布 与表达 分析丘脑底核 DBS 在海人酸致癫大鼠癫痫发生发展中对突触外 GABAA 受体 亚基表达的影响 为 DBS 治疗癫痫的机制提供一定的参考 宁夏医科大学硕士论文 前言 4 宁夏医科大学硕士论文 材料与方法 5 材料和方法材料和方法 1 材料 1 1 主要试剂及耗材 试剂及耗材名称 生产厂家 海人酸 Sigma 戊巴比妥钠 宁夏医科大学颅脑重点实验室提供 多聚赖氨酸 北京博奥森生物技术有限公司 多聚甲醛 天津市福晨化学试剂厂 枸橼酸钠 天津市光复科技发展有限公司 兔抗鼠 GABA 受体 亚基单克隆抗体 MILLIPORE 羊抗大鼠二抗试剂盒 北京中杉 DAB 试剂盒 TIANGEN 粘合剂 Sigma 公司 自凝牙托粉 上海医疗器械股份有限公司齿科材料厂 自凝牙托水 上海医疗器械股份有限公司齿科材料厂 漆包镍铬电极 直径 0 15mm 上海鼎阜金属材料有限公司 1 2 实验动物 同一批次 SD 雄性大鼠 清洁级 体重 230 280g 由宁夏医科大学实验动物中 心提供 1 3 主要仪器设备 仪器名称 生产厂家 脑立体定位仪 SR 5R Japan 生物电子刺激器 AM2100 USA Alpha Lab 多通道生理记录仪 ALAB000153 Israel ZH RXZ 柔性颅骨钻 USA 宁夏医科大学硕士论文 材料与方法 6 冷光四孔手术无影灯 广东汕头医疗器械厂 AL 104 精密电子天平 上海梅特勒 托利多仪器有限公司 4 冰箱 海尔 20 冰箱 海尔 80 冰箱 北京德天佑科技发展有限公司 实验室PH计FE20 上海梅特勒 托利多仪器有限公司 数显恒温磁力搅拌器 78HW 1 常州国华电器有限公司 自动磨刀机ZMD 2 上海医械模具厂 超纯水设备NW10VF Heal Force 微波炉 Galanz 电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司 电热恒温水热箱HH SY21 Ni 北京长源实验设备厂 CKX41SF 显微镜 OLYMPUS 1 4 主要试剂配制 1 4 1 PBS PH 7 4 称取 8g NaCl 0 24g KH2PO4 1 44g Na2HPO4 0 2g KCl 溶解于 950mL ddH2O 中 用 HCl 10mol L 1 和 NaOH 5mol L 1 调 PH 至 7 4 再加 ddH2O 定容至 1000mL 1 034 105Pa 高压蒸汽灭菌 20min 4 保存 1 4 2 生理盐水 0 9 称取 9g NaCl 溶于适量蒸馏水 待充分溶解 加蒸馏水定容至 1000mL 4 保存 1 4 3 4 多聚甲醛 称取 4g 多聚甲醛置于烧杯中 加入 100mL 0 1M 磷酸钠缓冲液 滴 加 1mol L 1 NaOH 于 60 搅拌器上溶解 1 4 4 5mg mL 1海人酸 200 L 小心准确称取海人酸 1mg 装入 200 L 离心管中 加 入 190 L 生理盐水 同时加入 1N NaOH 10 L 助溶 缓慢吹打至溶解后避光保存 注 意 海人酸应现用现配 1 4 5 0 01M PH6 0 柠檬酸钠 称取 3g 柠檬酸钠 0 4g 柠檬酸 溶解于 950mL 蒸馏水 中 用 HCl 10 mol L 1 和 NaOH 5mol L 1 调 PH 至 6 0 再加蒸馏水定容至 宁夏医科大学硕士论文 材料与方法 7 1000mL 2 方法 2 1 电极制作 采用镍铬合金漆包线自制 DBS 刺激电极和脑电信号记录电极 选取长度适中的漆 包线 利用锡焊和小插座相连 制作 DBS 刺激的双极电极和脑电信号记录的单极电极 在双极电极中 两个电极丝相互缠绕但尖端未短路 电极需保持电极丝上的保护漆未 破损掉落 使用前测试无短路和断路 2 2 动物选择与分组 清洁级同一批次 SD 雄性大鼠 24 只 体重 230 280g 自由喂养一周后用随机数 字法分为 3 组 正常对照组 癫痫对照组 DBS 治疗组 每组 8 只 动物除进行 DBS 治疗和脑电信号记录外 一般单笼饲养于固定动物饲养室 每日给予清洁饲料及饮水 2 3 注药套管与电极的植入 大鼠按照体重给与 1 戊巴比妥钠 50mg kg 1 腹腔注射麻醉 待动物麻醉后剃 除头皮手术野毛发 安装耳杆 将大鼠固定于脑立体定位仪上 分层切开头皮至颅骨 将颅骨上附着的骨膜组织等剃除干净 确定大鼠前囟位置 将其定为大鼠颅脑原点 依照 SD 大鼠大脑解剖图谱 确定海马左侧 CA3 区 前囟后 6 0mm 旁开 4 5mm 深 度 5 0mm 用牙科钻钻颅后植入直径 0 15mm 的镍铬合金金属丝制作的单极电极作为 脑电信号采集电极 对侧相同位置植入外直径 0 9mm 内直径 0 6mm 的注药套管作为 后期海人酸注射点 选取左侧 STN 前囟后 3 8mm 旁开 2 6mm 深度 8 0mm 埋 置相同金属丝制作的双极刺激治疗电极 在注药套管和电极位置确定好之后 将暴露 在颅骨表面的套管底座与电极底座用粘合剂固定于颅骨表面 同时在颅骨上固定四枚 螺丝作为电极与注药套管的固定桩 而后将套管 电极及螺丝用牙科水泥封闭 并留 一螺钉暴露顶端作为接地电极 手术完毕待大鼠清醒后将其放回笼内单笼饲养 2 4 海人酸模型建立 术后经过一周的恢复 除正常对照组外 其他各组均用 5 L 微量注射器经注药套 宁夏医科大学硕士论文 材料与方法 8 管给予 1 L 新鲜配置的海人酸 0 4mg mL 1 注射海人酸后 观察大鼠行为改变 按 照 Racine 法确定癫痫发生发展的级别与阶段 注射海人酸后 大鼠开始兴奋活跃 2 3min 后出现流涎 肢体抽搐等症状 所有大鼠在 30min 内均能表现出典型癫痫发 作症状 1h 内均能发展为 Racine 级癫痫大发作 海人酸注射 2h 后 每只大鼠腹腔 注射 0 5mL 安定终止癫痫发作 对照组大鼠注射等量生理盐水 经过 1 2d 的急性期 后 大鼠不再出现癫痫症状 行为平稳 此时大鼠进入静止期 持续 7 10d 后大鼠出 现反复自发的 级癫痫发作 偶有 级大发作出现 此时可认为进入慢性发 作期 2 5 DBS 治疗 进入慢性期后 空白对照组和癫痫对照组不给与刺激 仅观察行为变化 而 DBS 治疗组大鼠于每日相同时间给予丘脑底核治疗性刺激 治疗参数设置为频率 130Hz 波长 0 2ms 波幅 5v 的方波 每次持续刺激 30min 连续治疗 10d 2 6 脑电信号采集和处理 海人酸癫痫模型组动物进入慢性发作期后 每只大鼠每天固定时间记录脑电信号 10min 选取一个稳定信号记录文件 默认 180s 作为分析对象 连续记录 10d DBS 治疗组大鼠每天在 DBS 刺激治疗结束后 记录脑电信号 10min 选取稳定信号记录文 件作为分析对象 连续采集 10d 海人酸注射前 30min 将大鼠头部信号采集电极与脑电信号采集系统相连接 信号 经前置放大器放大 0 3Hz 3 0KHz 滤波 10KHz 采样率模数转化后存入电脑 海人 酸注射后采集两小时信号结束 以后每日每只大鼠固定时间采集脑电信号 30min 通 过 Alpha Omega 脑电信号采集系统记录大鼠癫痫发作及治疗过程中海马区域脑电信号 同时利用 NeuroExplorer 软件对脑电信号进行时域及频域分析 将脑电信号分解成低频 律信号 0 20Hz 和高频率信号 20 100Hz 两部分 分别计算每个文件功率谱密 度 power spectral density PSD 比较 DBS 治疗刺激对海马电生理模式的影响 脑电 信号输入到软件 SortingClient Alpha Omega 采用主成份分析和模板配对算法分离出 单细胞 spike 对采集到的信号离线分析 可分离出三种主要的 spike 信号 同时对每 宁夏医科大学硕士论文 材料与方法 9 个文件的 spike 数量进行统计 2 7 脑组织取材 各组 SD 大鼠于 DBS 治疗结束后 腹腔注射 1 戊巴比妥钠进行麻醉 50mg kg 1 经升主动脉插管 PBS 冲洗后灌注 4 多聚甲醛 400mL 直到四肢痉挛粘膜变白 取脑 组织 浸入 4 多聚甲醛中 固定 24h 后 进行常规石蜡包埋 2 8 切片的制作 将固定后的组织取出 用刀片修整组织块 而后放入不同浓度的酒精 80 酒精 90 酒精 95 酒精 无水乙醇 与无水乙醇 中进行逐级脱水 各种浓度下脱水时 间分别为 24h 10h 12h 40min 40min 将脱水后的组织块置于二甲苯 和二甲苯 进行两次透明 时间均为 40min 随后将组织块放入熔融状态的石蜡 约 60 中 浸蜡 50min 用镊子夹住组织块放入盛有熔融石蜡的铁槽内进行包埋 根据组织块的 大小 修整蜡块 便于切片 在切片机上将组织块切成约 5 m 的薄片 将其裱贴于用 多聚赖氨酸处理的载玻片上 标记 而后置于 60 烤箱中烘烤 1h 2 9 Nissl 染色 切片经二甲苯 二甲苯 和二甲苯 梯度酒精 70 酒精 80 酒精 90 酒 精 95 酒精 脱蜡至水 每步各 10min 蒸馏水浸洗 5min 后 将切片放入预热至 56 的 1 甲苯胺蓝浸染 20min 蒸馏水漂洗 5min 70 酒精中反应约 lmin 95 酒精 分化 1min 无水乙醇迅速脱无水乙醇脱水 透明 封片 2 10 免疫组织化学染色 2 10 1 将切片置于 60 烤箱中烘烤 1h 后入二甲苯 和二甲苯 中脱蜡 时间均为 10min 2 10 2 将切片放入不同浓度的酒精 无水乙醇 与 95 酒精 90 酒精 80 酒精 70 酒精 中逐级浸水 时间均为 5min 2 10 3 用 0 01mol L 1 PH 6 0 的枸橼酸钠进行抗原修复 95 修复 5min 2 10 4 将 3 H2O2滴在切片上 孵育 10min 倾去残液 用 PBS 清洗 3 次 每次 5min 以消除内源性过氧化物酶 宁夏医科大学硕士论文 材料与方法 10 2 10 5 将山羊血清封闭液滴于组织片上 封闭 40min 2 10 6 滴加 1 200 稀释的兔源性 GABAA 受体 亚基多克隆抗体 用 ddH2O 稀释 4 过夜 PBS 冲洗 3 次 每次 5min 2 10 7 加入 1 500 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗 用 ddH2O 稀释 37 1h PBS 冲洗 3 次 每次 5min 2 10 8 按每 1mL HRP 反应缓冲液加入 50 L 试剂 A 和 50 L 试剂 B 的比例配制 DAB 显色液 向切片上顺次滴加显色液 避光静置 10min 显微镜下观察染色情况 用自 来水充分冲洗终止显色 2 10 9 将切片浸入苏木素染液中 浸泡 60s 复染细胞核 而后用自来水冲洗 15min 2 10 10 用 1 盐酸酒精分化 30s 2 10 11 由低浓度酒精到高浓度酒精进行逐级脱水 70 酒精 80 酒精乙醇 90 酒精 95 酒精 无水乙醇 与 时间均为 1min 2 10 12 用二甲苯 和二甲苯 进行透明 时间分别为 5min 和 3min 2 10 13 用中性树胶封片后 显微镜下观察染色结果 并拍照 2 11 数据统计 癫痫组大鼠和 DBS 治疗组大鼠进入慢性发作期后 根据 Racine 分级选取三级发作 及以上级别的发作次数进入我们的统计量 大鼠发作次数的差异在癫痫组和 DBS 治疗 组之间进行比较分析 统计 DBS 治疗组大鼠每天的平均癫痫发作次数 观察比较发作 次数发展趋势 对选入的脑电信号记录全部输入软件 NeruroExplorer 计算 LFP 的平均 PSD 同 时计算出每个数据的 spike 数量 比较癫痫组与 DBS 治疗组之间的差异 所有的癫痫 动物包括治疗组 计算各阶段平均 spike 数量变化 Nissl 染色的切片在齿状回颗粒细胞层置显微镜下 调物镜为 20 倍 随机选取 20 个视野计数神经元 以 15 张大鼠脑组织随机切片作为统计量 免疫组织化学染色切片 采用 Axio Vision 软件进行 亚基表达分析 计算每张切片积分光密度值 IOD 将 宁夏医科大学硕士论文 材料与方法 11 其作为表达量的表征 所有统计数据均采用 SPSS11 5 软件包进行统计处理 计量资料 以均数 标准差 s 表示 各个组间比较采用单因素方差分析 P 0 05 为差异有 x 显著性 宁夏医科大学硕士论文 结果 12 结结 果果 1 丘脑底核 DBS 治疗抑制慢性期大鼠癫痫发作的频率 每天观察大鼠 6h 记录癫痫组和治疗组大鼠癫痫发作情况 按照 Racine 分级标准 将 3 级的癫痫发作数量计入统计范围 进入慢性发作期 癫痫组大鼠和治疗组大鼠连 续统计 10d 癫痫对照组每只大鼠平均每天发作 17 31 4 59 n 8 次 而 DBS 治疗组每 只大鼠平均每天发作 6 01 4 87 n 8 次 治疗组发作次数明显小于癫痫组次数 说明 DBS 电刺激治疗可以抑制癫痫大鼠癫痫大发作 图 1 在 DBS 治疗组的连续 10d 的 治疗过程中 癫痫发作次数逐渐降低 图 2 2 丘脑底核 DBS 治疗改变了癫痫大鼠海马电生理模式 对照组大鼠除在注射生理盐水过程中行为活跃外 没有出现其它异常表现 无癫 痫发作 海马区采集到的脑电信号表现为振幅为 200 500mv 的平稳信号 图 3 A 癫痫组与 DBS 治疗组大鼠脑电信号在注射海人酸之前没有特殊表现 与对照组相似 注射海人酸后 经历 37 1 26 6 s n 16 的潜伏期 海马 LFP 信号中开始出现振幅高于 基线的异常放电 振幅约为 2000mv 持续约 1 2s 分析发现频率由正常的 0 5 15 Hz 图 4 A 提升最高到 400 Hz 图 4 B 随着时间推移 异常放电振幅逐渐增大 持续时间延长 最后表现为连续的高振幅 高频率的癫痫样放电 图 3 B 海马区异 常放电与动物行为相一致 给予安定终止发作后 大鼠癫痫发作终止 动物行为平稳 海马区脑电信号恢复正常平稳状态 在癫痫发作慢性期 海马出现复杂的癫痫发作异常放电 这种异常放电主要有两 种波形形式 图 5 A 一种是频率分布较宽的棘样放电 图 5 B1 另一种是频率分 布较窄 主要变现为较低频律的尖样放电 图 5 C1 这两种波形在动物行为上略有差 异 棘样放电的动物表现主要为面部与肢体的抽搐 动物面部与上肢肌肉快速抽动 不伴有较大幅度的活动 尖样放电时动物表现为湿狗样甩头 上下肢较大范围的运动 动物也可以表现为跳跃等动作 分析这两种不同的异常放电 结果显示 棘样放电的 高能量频率主要成分范围较宽 可以达到 100Hz 甚至以上 图 5 B2 而尖样放电的 宁夏医科大学硕士论文 结果 13 高能量频率主要成分范围较窄 一般不超过 40Hz 主体成分保持在 20Hz 以内 图 5 C2 随着丘脑底核 DBS 治疗的进行 海马区域采集到的 LFP 不同频率范围的平均 PSD 逐渐减小 表一 分析治疗早期 治疗 5d 后 LFP 频率分布发现 与治疗前相比 低频律信号 0 20Hz 平均 PSD 由癫痫大发作时的 80 92 2 43 db n 8 降为 60 35 1 22 db n 8 而高频率信号 20 100Hz 平均 PSD 则由 82 67 2 55 db n 8 降为 30 14 2 84db n 8 在治疗早期 高频率信号明显受到抑制 且对治 疗刺激的敏感性高于低频律信号 图 5 在治疗晚期 治疗 10d 后 低频律信号平均 PSD 由 60 35 1 22db n 8 降为 23 54 3 48db n 8 而高频率信号平均 PSD 由 30 14 2 84 db n 8 降到 20 31 2 92db n 8 表明 DBS 刺激最终抑制了低频信号 图 6 可以看出 在治疗晚期 治疗 10d LFP 信号变得平稳 且振幅只有 600mv 左右 这时的脑电信号与正常脑电信号非常相似 神经元单细胞 spike 分离出三种不同波形的信号 可看作是电极附近三个或者三类 神经元放电的三种不同模式 图 7 对每个记录数据进行 spike 计数发现 从海人酸 注射到慢性癫痫发作出现期间 神经元的放电频率表现出与动物行为一致的变化 在 正常状态下神经元放电频率较低 急性发作期放电频率升高 潜伏期时 放电频率又 降低了 最后进入慢性发作期 神经元放电频率升高 图 8 然而 在 DBS 治疗组和 癫痫组之间 尽管治疗组的癫痫发作得到明显抑制 但神经元放电频率并没有明显改 变 图 9 3 丘脑底核 DBS 抑制癫痫大鼠海马神经元坏死 Nissl 染色结果显示 正常对照组海马椎体细胞排列整齐 边缘清晰 呈多角形 可见核仁 神经元突触向内层放射状伸展 癫痫组海马大量神经元细胞表现固缩浓染 坏死 核仁消失 突触断裂 胞浆染色深浅不一 突触排布卷曲杂乱 齿状回颗粒细 胞层增厚 胶质细胞增生明显 DBS 治疗组海马部分神经元细胞表现固缩浓染坏死 核仁消失 突触断裂 胞浆染色深浅不一 突触排布卷曲杂乱 但是齿状回神经元细 胞相对正常 胶质细胞增生不明显 图 10 宁夏医科大学硕士论文 结果 14 神经元细胞计数显示 正常大鼠海马齿状回神经元计数平均为 489 75 45 15 n 8 癫痫组大鼠海马齿状回神经元计数平均为 357 12 20 50 n 8 DBS 治疗组 大鼠海马齿状回神经元计数为 463 62 38 41 n 8 癫痫组大鼠神经元数量明显少于 正常组 P0 05 没有统计学意义 DBS 治疗组大鼠的脑神经元细胞与胶质细胞较癫痫对照组病理损伤 较轻 提示 DBS 刺激对神经元具有保护作用 4 丘脑底核 DBS 增加了癫痫大鼠突触外 GABA 受体 亚基的表达 免疫组织化学染色结果显示 正常对照组大鼠脑组织突触外 GABA 受体 亚基主 要分布在海马 IOD 30 96 2 73 n 8 与丘脑腹外侧核 IOD 32 85 2 35 n 8 图 11A 癫痫组大鼠脑组织海马 IOD 12 31 1 72 n 8 及丘脑腹外侧核 IOD 22 39 1 94 n 8 突触外 GABA 受体 亚基表达下降 图 11B DBS 治疗组 的丘脑腹外侧核 IOD 35 91 3 97 n 8 突触外 GABA 受体 亚基与正常对照组相比 较表达增强 P 0 05 海马区 IOD 22 74 2 08 n 8 突触外 GABA 受体 亚基表 达低于正常对照组 P 0 05 但是比癫痫组表达增高 P 0 05 图 11C 此结果显示 DBS 刺激明显增加了丘脑突触外 GABAA 受体 亚基的表达 同时提高了海马区突触 外 GABAA 受体 亚基的含量 宁夏医科大学硕士论文 讨论 15 讨讨 论论 多种动物能建立癫痫模型 包括蛙 爬行动物 大鼠 小鼠 免 狗 猫 恒河 猴和狒狒等 35 36 海人酸是颞叶癫痫模型制作常用的药物 海人酸模型的制作可通过 多种方法实现 主要在于给药方式的不同 海人酸可以通过腹腔 静脉等全身用药 也可以通过立体定向下颅内局部给药 包括脑室内给药 脑实质注射给药 不同的给 药方式尽管各有优缺点 但是都可以成功建立颞叶癫痫模型 由于海人酸的价格较高 购买渠道狭窄 因此和全身用药相比较 局部脑组织注射海人酸是一种较为经济的模 型制作方式 传统的模型制作方式是在动物麻醉的状态下 根据大鼠大脑图谱选定药物注射点 坐标 利用立体定向仪确定注射位置 采用微量注射仪局部注射海人酸 37 但是这种 模型制作方式有一些难以避免的缺陷 首先 在注射药物时 动物的麻醉会掩盖海人 酸注射后的药物效果 海人酸局部脑组织注射时 药物不通过体内代谢直接作用于海 马与临近脑组织 从以往及现在的研究观察 我们发现海人酸的局部注射起效潜伏期 非常短 只有不到一分钟的时间 如果利用立体定位仪直接局部注药 此时动物还没 有从麻醉中清醒 这样我们很难判断常规方式下急性期海人酸对动物的行为学影响 其次 常规利用立体定位仪注射海人酸时 难以将由急性穿刺造成的创伤因素从实验 中排除 尤其当牵扯到脑电信号的采集记录时 这种创伤所造成的干扰是不可忽视的 本研究采用药物注射点预置套管 待动物从手术的创伤中恢复过来 完全清醒自由活 动状态下 用脑电信号记录 同时可以通过套管注射药物 这样既可以观察到药物作 用的动物行为变化特点 还可以记录到注药前后的脑电信号 为海人酸癫痫动物模型 的电生理研究创造基础 海人酸癫痫动物模型无论以何种注药途径制作 其临床表现较为相似 根据临床 症状可分为急性期 海人酸注射 2d 内 潜伏期 急性期后 10d 2 月 和慢性期 大鼠出现 自发性癫痫发作后 在海人酸注射急性发作后到反复自发癫痫发作之间的潜伏期差异 较大 不同的实验手段和不同的实验室环境甚至相同实验动物分组当中都不相同 从 宁夏医科大学硕士论文 讨论 16 几天到两月 5 对照其他研究方式和结果我们发现潜伏期的长短和药物注射方式密切 相关 一般全身用药动物的潜伏期较长 且动物之间的差异较大 而局部用药的潜伏 期较短 动物个体之间差异较小 本实验的结果显示动物潜伏期在 3 10d 之间 这是 实验中的一个优点 当然 影响动物模型潜伏期长短的因素比较多 我们将在后续实 验中探索主要的影响因素 在本实验中 我们采用镍铬合金漆包线作为电极材料 这种材料较为柔软 尽管 在植入时对操作的要求较高 但是其对动物脑组织的创伤较小 是一种理想的电极材 料 同时 在电极的植入点周围的颅骨上固定螺丝 使得牙科水泥在凝固时将电极和 颅骨紧密牢固固定成为一个整体 在试验中可以避免电极的脱落 此种实验手段是一 种较为合理的方法 DBS 治疗的靶点可有多种选择 如丘脑前核 丘脑正中核 尾状核 海马杏仁核 蓝斑和丘脑底核等 不同的靶点都有不同程度的治疗效果 38 39 40 41 对丘脑底核 DBS 治疗的研究发现 DBS 对癫痫的治疗具有明显的频率依赖性 42 43 因此 选择丘脑底 核作为实验的治疗靶点 主要目的是通过这个相对成熟的治疗手段 来检测其在治疗 作用中的远隔效应和生物化学效应 DBS 对大脑的电生理影响是多方面的 包括对各种范围的神经元震荡波的影响 44 本研究发现 在癫痫动物模型海马部位 较有意义的脑电信号主要集中在 100HZ 以下 因此对采集到的脑电信号采用 100Hz 低通滤波 只分析 100Hz 以下的部分 根据实际 的观察 将频率分为 0 20Hz 的低频律和 20 100Hz 的高频率范围 从宏观上比较了 大范围频率的变化特征 而更细微的脑电模式改变有待于进一步的研究分析 实验中癫痫大鼠慢性发作开始时给予 DBS 治疗 这种治疗有效抑制了癫痫的发作 和癫痫组大鼠相比较 治疗期间治疗组动物癫痫发作次数明显减少 Nissle 染色结果显 示 癫痫组大鼠海马组织神经元坏死和增生同时存在 而治疗组海马神经元坏死和增 生现象相对较轻 和摘要里的结果一致 表明 DBS 治疗可以抑制海马神经元坏死增 生的发展 但是不能逆转海人酸对海马组织的病理损伤 海马