《基金申请的策略与技巧讲座》

基金申请的策略与技巧讲座基金申请的策略与技巧讲座 选题 撰写申请书 答辩撰写前的准备 好心情 好身体边想边写3h 天 读指南 读通知注意截止期 读标书 读高手 读同行 读自己卖 点 选题创新性工作基础 想法变文字一气呵成 立项依据 沟通 科研科 87330567 医科处87333055摘要研究内容和意义 限400字 1 基础 继续和深入发表和未发表创新2 问题中肯3 预实验针对 问题 的 预实验结果4 假设思想性 创新性5 方法可靠性第一先进性第二6 目标明确 具体7 意义理论性和应用性立项依据1 关键 占50 文笔 流畅 层次分明 逻辑性强2 要求 充分的理由和意义思想性与摘要 呼应3 自己的工作为依据图文并茂规范4 参考文献时效性自己的文 章规范化5 深入浅出内行 外行读得懂6 人文文化素质精神动人的 故事神经元凋亡时SP1对BH3 only蛋白Bim的转录调控细胞凋亡时SP1对BH3 only蛋白Bim的转录调控神经元凋亡时BH3 only蛋白Bim的转录调控神经元凋亡时SP1对BH3 only蛋白Bim的调控SP1对BH3 only蛋白Bim的转录调控SP1对神经元凋亡的调控作用 关键词 SP1 B im 基因调控 信号转导 神经元凋亡项目名称研究目标 获得SP1直接 调控bim基因表达的可靠证据 阐明促凋亡蛋白Bim由SP1转录调控的 新机制 为确立SP1作为神经退行性疾病治疗的新靶点提供更充分的 科学依据 要求 明确 具体解决学术问题神经元凋亡时SP1对BH3 only蛋白Bim的转录调控与题目相呼应研究内容 紧紧围绕研究目标 1 证明bim启动子核心区的SP1结合序列是否介导了bim基因的上调为 了证实bim启动子核心区的SP1结合序列是否介导了bim基因的上调 将其中的SP1结合序列进行点突变 使其不能结合SP1 确定这一突变 是否能够消除bim启动子的撤钾反应 2 分析SP1是否能够与bim启动子核心区的SP1结合序列结合应用EMSA Electrophoretic MobilityShift Assay 技术 证实bim启动子核心区的SP1结合序列是否能够与SP1结 合 进一步采用CHIP Chromatin immunoprecipitation 方法 获得SP1与bim启动子核心区在细胞内结 合的证据 3 从bim的mRNA和蛋白质水平 观察负显性SP1是否能够抑制撤钾诱导 的bim基因的上调质粒转染CGNs的转染率只能达到0 1 1 0 腺病毒的感染率可达70 80 1 因此 构建dnSP1的腺病毒载体Ad dnSP1 感染CGNs才能达到可靠分析bim的mRNA和蛋白质表达水平改变 的目的 4 分析SP1诱导Bim这一机制对神经元凋亡的调控作用确立SP1转录激 活bim这一机制后 进一步分析这一机制对神经元凋亡的调控作用 拟解决的关键问题获得SP1直接调控bim基因表达的可靠依据 什么是关键问题 研究过程中对达到预期目标有重要影响的某些研究内容或因素 为达到预期目标所必须掌握的关键技术或研究手段 撰写要求 找出关键问题 问题清晰 分析透彻 合理的解决方法 研究方案 项目需求为前提 可靠性第一 先进性第二 参考文献 突出关键技术的描述 不主张使用流程图 建议开头 有关方法 技术路线 试验手段 关键技术综述如下 可行性分析 从学术思想角度提出1 工作基础 学术思想 2 科研梯队 3 实验条件4 实验技术5 交流与合作 国内 国外 创新性对创新的 理解 创新性与先进性是有根本区别的 原始创新 填补空白或修改传统的理论 新技术 新方法的发明创造 跟踪创新 在前人工作基础上补充 完善现有理论 对原有技术 方 法进行修改后产生1 1 2的效果 本项目的特色与创新之处 申请人首次报道了神经元凋亡时促凋亡蛋 白Bim上调是不依赖于JNK c Jun通路 Leyu Shi et al Neurosci Lett xx 一观察之后 又以可靠的实验结果证明PI3K Akt FKHRL1信 号通路也不参与bim的上调 见立项依据 bim上调的转录机制是什么 我们率先对bim启动子进行了5 末端序 列续减分析 确立了诱导bim表达的启动子核心区 进而发现一个典型 的转录因子SP1结合序列位于其中 进一步实验显示 神经元凋亡时SP1被激活 负显性SP1突变体和SP1 DNA结合抑制剂mithramycin A可抑制bim的上调 根据以上生物信息学分析和实验观察 我们首次提出了SP1介导bim上 调这一新的bim转录机制 神经元凋亡时转录因子SP1被激活 激活的S P1与bim启动子核心区的SP1结合序列结合 从而转录激活bim的表达 本项目拟进一步采用负显性SP1突变体的腺病毒表达技术以及启动子 点突变 EMSA和CHIP方法 旨在获得SP1直接调控bim基因的可靠证据 为阐明SP1对促凋亡蛋白Bim的调控作用和机制并进一步确立SP1作 为神经退行性疾病治疗的新靶点提供更充分的科学依据 1 研究基础已取得的研究工作成绩及与本项目有关的研究工作积累 对于自由申请项目 着重填写申请人近期的主要工作业绩 对于重点 项目 请着重填写本课题组与本项目相关的研究工作积累和近五年的 主要研究业绩 2 工作条件已具备的实验条件 尚缺少的实验条件和 拟解决的途径 包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与 落实情况 研究基础在国家自然科学基金 已结题三项 正进行一项 的资助下 近五年有如下工作积累和成绩 1 SCI论文近五年发表了14 篇SCI论文 其中与神经元凋亡的信号转导和基因调控有关的论文 作 为第一作者的有2篇 作为通讯作者的有4篇 见后 作为共同作者的 有8篇 2 Bim转录机制的前期工作我们首次报道了神经元凋亡时JNK c Jun不参与bim的上调 1 随后 我们又以可靠的证据揭示了PI3K Akt FKHRL1也不介导bim的上调 未发表资料 这些研究工作改变了以往的观点 也是本项目重要的立项依据之一 3 Bim启动子核心区确立启动子5 末端序列续减分析确立了诱导Bim 表达的启动子核心区 并发现一个典型的转录因子SP1结合序列位于 其中 进一步实验显示 神经元凋亡时SP1被激活 负显性SP1突变体和SP1 DNA结合抑制剂均可抑制Bim的上调 这些实验资料揭示了SP1介导bim转录调控的新机制 也为本项目申请 提供了最根本的实验依据 4 转录因子调控神经元凋亡的工作基础另一项转录因子MEF2抗神经 元凋亡的工作也显示了申请人与本项目相关的较扎实的研究工作积 累 本人首次报道 Mingtao Li et al J ofNeurosci xx 21 6544 6552 随后被他人证实 Shu ichi Okamoto et al PNASxx 99 3974 3979 神经元凋亡时转录因子MEF2A和MEF2D不仅活性降低和失去抗 凋亡作用 而且被凋亡杀手caspase剪切 其N 末端产物反而具有促凋亡活性 这一MEF2调控凋亡机制的发现 不仅对于我们理解神经元存活或凋亡 具有重要的意义 而且也为神经系统的发育和分化的研究开拓了一条 崭新的思路 具有创新性 5 信号转导的工作基础较早的一项对cAMP PKA抗神经元凋亡机制的 研究也反映了本人在神经元凋亡信号转导的研究方面有较厚实的工 作积累 申请者首次发现促凋亡激酶GSK 3 和GSK 3 是PKA的天然底物 阐明cAMP PKA通过磷酸化并抑制GSK 3 发挥其促神经元存活的作用 此内容发表在 分子细胞生物学 Mingtao Li et al Mol CellBiol 2000 20 9356 9363 6 JNK c Jun通路的工作基础我们首次以JNK c Jun为直接靶点 用小分子JNK抑制剂 SP600125 治疗帕金森病动物 证实JNK是有效的治疗靶点 此工作发表后 Neuroscience Research xx 48 195 202 得到了国际同行的认可 SCI期刊Drug NewsPerspectives邀请本人撰写了有关 以JNK为靶点治疗帕金森病 的专题综述 JNK Inhibitionas aPotential Strategyin TreatingParkinson s Disease Drug NewsPerspect xx 17 646 54 SCI文章1 Leyu Shi Shoufang Gong Zhongmin Yuan Chi Ma Yanling Liu Chuanfu Wang Wenming Li Rongbiao Pi Shoujian Huang Ruzhu Chen Yifan Han Zixu Mao and Mingtao Li 通讯作者 Activity deprivation dependent inductionof theproapoptotic BH3 only proteinBim isindependent ofJNK c Jun activationduring apoptosisin cerebellar granule neurons Neurosci Lett xx 375 7 12 2 Wenya Wang Chi Ma Zixu Maoand Mingtao Li 通讯作者 JNK inhibitionas apotential strategyin treatingParkinsons s disease Drug NewsPerspect xx 17 10 646 54 3 Wenya Wang Leyu Shi Yuanbin Xie Chi Ma Wenming Li Xingwen Su Shoujian Huang Ruzhu Chen Zhenyu Zhu Zixu Mao Yifan Hanand Mingtao Li 通讯作者 SP600125 a newJNK inhibitor protects dopaminergieurons in the MPTPmodel ofParkinson s disease Neurosci Resxx 48 195 2024 Yuanbin Xie Yanling Liu Chi Ma Zhongmin Yuan Wenya Wang Zhenyu Zhu Guoquan Gao Xianguo Liu Hengxin Yuan Ruzhu Chen Shoujian Huang Xuelan Wang Xiaonan Zhu Xuemin Wang Zixu Maoand Mingtao Li 通讯作者 Indirubin 3 oxime inhibitsc Jun NH2 terminal kinase anti apoptotic effectin cerebellargranule neurons Neurosci Lett xx 367 355 359 5 Rongbiao Pi Wenming LiNelson T K Lee Hugh H N Chan Yongmei Pu Ling NgaChan Nikolaus J Sucher Doanld C Chang Mingtao Liand Yifan Han Minocycline prevents glutamate induced apoptosisof cerebellargranule neuronsby differentialregulation ofp38and Aktpathways J Neurochem xx 91 1212 1230 Wenya Wang Chi Ma Zixu Maoand Mingtao Li 通讯作者 JNK inhibitionas apotential strategyin treatingParkinsons s disease Drug NewsPerspect xx 17 10 646 54 6 Wenming Li Rongbiao Pi Hugh H N Chan Hongjun Fu Nelson T K Lee Hing WaiTsang Yongmei Pu Donald C Chang Chaoying Li Jialie Luo Keming Xiong Zhiwang Li Hong Xue Paul R Carlier Yuanping Pang Karl W K Tsim Mingtao Liand Yifan Han Novel dimericAChE inhibitorBis 7 tacrine but notDonepezil preventsglutamate induced neuronalapoptosis byblocking NMDAreceptors J BiolChem xx 280 18 18179 88 7 Xuemin Wang Xiaoli Tang Mingtao Li John Marshall Zixu Mao Regulation ofneuroprotective activityof myocyte enhancer factor2by cAMP PKA signalingpathway inneuronal survival J BiolChem xx 280 17 16705 13 8 Marcus Wiedmann Xuemin Wang X iaoli Tang Mingtao Li Zixu Mao PI3K Akt dependent regulation of thetranscription factormyocyteenhancerfactor 2in insulin like growthfactor 1 and membranedepolarization mediated survivalof cerebellargranule neurons J Neurosci Res xxxx81 2 226 234 9 Mingtao Li Xiaomin Wang Mary KayMeintzer Tracey Laessig Morris J Birnbaum and Kim A Heidenreich Cyclic AMPpromotes neuronalsurvival by phosphorylation ofglycogen synthasekinase3 Mol CellBiol 2000 20 24 9356 9363 10 Mingtao Li Daniel A Linsenman Melissa P Allen Mary KayMeintzer Xiaomin Wang Tracey Laessig Margaret E Wierman21 17 6544 6552 11 Daniel A Linseman Christopher M Bartley Shoshona S Le Tracey A Laessig Ron J Bouchard Mary KayMeintzer Mingtao LiandKimA Heidenreich Inactivation of the MyocyteEnhancer Factor 2Repressor HistoneDeacetylase 5by EndogenousCa2 Calmodulin dependent KinaseII PromotesDepolarization mediated CerebellarGranule NeuronSurvival J BiolChemxx 278 41472 41481 12 Jing Ping Yun Choong Tsek Liew Eng ChingChew Xiao Yu Yin Paul BoSan Lai Yam HinFai H K Richard Li Mei Lin Jin Ming Xiao Ding Mingtao Li Han Liang Lin and WanYee Lau Nuclear MatrixProtein Expressionsin Hepatocytesof Normaland CirrhoticRat LiversUnder Normaland RegeneratingConditions J CellBiochem xx 91 1269 1279 13 Hongwei Yang Xiaodong Hu Hongmei Zhang Wenjun Xin Mingtao Li Tong Zhang Lijun Zhouand XianguoLiu Roles of CaMKII PKA and PKCin theinduction andmainternance ofLTP ofC fiber evoked fieldpotentials inrat spinaldorsal horn J Neurophysiol xx 91 1122 1133 14 Nengwei Hu Hongmei Zhang Xiaodong Hu Mingtao Li Tong Zhang Lijun Zhouand XianguoLiu Protein SynthesisInhibition Blocksthe Late Phase LTPofC Fiber EvokedField Potentialsin RatSpinal DorsalHorn J Neurophysiol xx 89 2354 235915 Juan Sun MingtaoLi Jiahuai Hanand JunGu Sensitization ofdifferentiated PC12cells toapoptosis bypresenilin 2is mediatedbyp38 Biochem Biophy Res Commun xx 287 536 541 16 Weibin Cai Jianfang Ma Chaoyang Li Zhonghan Yang Xia Yang Wei Liu Zuguo Liu MingtaoLi Guoquan Gao Enhanced anti angiogenic effectof adeletion mutantof plasminogenkringle5on neovascularization J CellBiochem xxSep15 in press 17 Ming YANG Cun you WAGN Feng ZHOU Jing TAO Tao LIU Hai yan WEI Wei LIU Ming taoLi Xian song FENG Proteomic Analysisin theEarly Processof PancreaticRegeneration inthe PancreatectomizedRat Acta PharmacologicaSinicaxx in press 工作条件xx年回国 获得211基金180万元 组建了一流的分子 细胞生物学实验室 xx年 作为负责人获得一期985学科建设经费700万元 筹建了一流的 蛋白质组学实验室并正在主持开展蛋白质科学的前沿性工作 近三年 培养和汇聚了一支从事分子神经生物学和蛋白质组学研究的 科研队伍 这些建设性工作为解决细胞信号转导 基因调控以及本项目的核心 问题奠定了扎实的基础 项目负责人黎明涛所在单位 中山大学基础医学院药理教研室是211项目资助学科和国家重点学科 人才济济 科研装备精良 近三年 药理教研室获得学科建设资金3000万元 已购置大型仪器如 质谱仪 激光共聚焦显微镜 超速离心机 流式细胞仪 高效液相 和蛋白质分离纯化系统等 这是申请者视为非常可贵的研究工作环境 申请者简历 学历 研究工作简历 近期已发表与本项目有关的文章目 录 获得学术奖励情况 在本项目中承担的任务 黎明涛 Li Mingtao 项目负责人 中山大学基础医学院药理教研室教授 博士生 导师 中山医学院蛋白质组学实验室主任 于1984年 1989年和1996年分别获得医学学士 硕士和博士学位 主要研究领域是神经元凋亡的信号转导 基因调控和蛋白质组学 在美国Department ofPharmacology University ofColorado HealthSciences Center从事两年博士后研究 1999 xx 主攻凋亡的信号转导 基因调控和蛋白质组学 近五年发表了14篇SCI论文 其中 作为第一作者 在国际核心杂志Mol ecular andCellular Biology Impact Factor 10 03 和Journal ofNeuroscience IF 8 4 发表了具有创新性的文章 作为通讯作者 最近在Neurosci Res IF 2 4 和Neurosci Lett IF 2 2 等期刊上发表了开拓性的文章 近五年 1998 xx 作为第一主持人获得13项基金 包括 4项国家自然 科学基金 5项省自然科学基金 3项市基金 1项教育部基金 发表的相关论文1 Leyu Shi Shoufang Gong Zhongmin Yuan Chi Ma Yanling Liu Chuanfu Wang Wenming Li Rongbiao Pi Shoujian Huang Ruzhu Chen Yifan Han Zixu Mao and MingtaoLi 通讯作者 Activity deprivation dependent inductionof theproapoptotic BH3 only proteinBim isindependent ofJNK c Jun activationduring apoptosisin cerebellargranule neurons Neurosci Lett xx 375 7 12 2 3 皮荣标 Pi Rongbiao 33岁 博士学位 讲师 xx年毕业于中山大学 获神经药理学博士 同年赴香港科技大学生物化学系从事博士后研究 现在中山大学药学 院任讲师 主要研究兴趣涉及神经保护药物的作用及其机制的研究 曾负责或参加包括国家自然科学基金等多项研究 已发表或待发表论著近20篇 其中SCI论文5篇 皮博士与本人合作达11年 有共同的研究趣向 作为共同作者发表多 篇SCI论文 他掌握了本项目涉及的大部分实验方法和技术 尤其在腺病毒载体构 建方面积累了经验 见文章 主要负责腺病毒载体构建等工作 发表的相关论文1 Rongbiao Pi Wenming Li Nelson T K Lee Hugh H N Chan Yongmei Pu Ling NgaChan Nikolaus J Sucher Doanld C Chang MingtaoLiand Yifan Han Minocycline preventsglutamate induced apoptosisof cerebellargranule neuronsby differentialregulationofp38and Aktpathways J Neurochem xx 91 1212 1230 2 3 项目组主要成员经费申请表黎明涛先生 您好 您 申请的项目经专家投票表决 同意资助 关于你的项目的同行评议意见如下 1 本项目在小脑颗粒细胞撤钾的 离体凋亡模型中 发现了一种直接调节Bim的新转录因子SP1 申请人 试图采用腺病毒转染技术 基因突变以及分子生物学方法进一步论 证SP1是直接调控bim基因的这一假说 立项具有前言性 申请人工作基础好 并与美国Emory大学 香港大学 有长期的合作条件 完全能够完成本项课题 建议优先资助 2 本项课题的立项依据较为充分 具有一定的学术创新及科学意义 研究内容明确 技术路线清晰 研究方法和方案可行 申请者有较高的学术水平 以及多次主持国家自然科学基金课题的经 验 同时 申请者所在单位又有比较好的实验室及条件 建议给予资助 3 课题研究具有较好的工作基础 研究具有较高的学术价值 建议资 助 4 同意资助 理由 该项目立论依据充分 其重要的意义表现在澄清撤钾诱导神经 元凋亡时 Bim上调的细胞内信号转导机制 申请者有较好的研究基础和研究能力 项目的内容设置合适 重点突 出 总体方案合理 技术路线可行 可资助 5 This isa nicelywriten proposalwith aclear aimand practicalapproaches Further the grouphas publishedresults relatedto thecurrent proposal indicating theability ofthe groupto performthe experiments 获得资助的决定因素 工作基础好 学术创新性及学术 价值 立项依据充分 研究内容明确 技术路线清晰 重点突出 方案 合理 国际合作祝大家新年快乐 在新的一年获得更多基金 充满自 信 激情 仪表和体语 特点 专家心理 按提前结束做准备 准备充 分幻灯小道具 口头表达准确性 情感性 可信性和简明性 开门见 山 突出主题做什么 为什么 怎样做 突出特色和创新黎明涛中山 大学基础医学院立论依据现状 1 发病情况 世界性 中国 100万 美 国100万2 病理特征 黑质多巴胺神经元凋亡纹状体多巴胺含量3 治 疗现状 左旋多巴 对症治疗 疗效不理想 安全性受到质疑以JNK为新靶点治疗PDxx年 省重点项目 15万元 资助MLK JNK SP600125 c Jun 凋亡JNK PD1 保护多巴胺能神经元2 改善行为学指标3 提高黑质多巴胺浓度1 四篇SCI文章 通讯作者2 人才培养 1名博士2名硕士以JNK CDK5 GS K3 为靶治疗PD JNKNeurosci Resxx 48 195 202Drug NewsPerspect xx17 10 646 54GSK3 MingtaoLi et al unpublished dataCDK5PNAS USAxx 100 23 13650 5抑制JNK CDK5 GSK3 的方案1 三种抑制剂联合2 一种抑制剂 一 石三鸟 Indirubin 3 oxime 靛玉红衍生物 是CDK 5 GSK 3 的抑制剂 Nat CellBiol 19991 1 60 7 J BiolChem xx 5 276 1 251 60靛玉红直接抑制JNK活性JNK Indirubin 3 oxime inhibitedMPP induced apoptosisin cultureddopaminerbic neurons a control red forTH positive neurons b 10 M MPP decreased TH positive cellsand reducedcytoplasmic volume indirubin 3 oxime3 M c and5 M d rescued TH positive cellsIndirubin 3 oxime preventedloss ofdopamine neuronsafter MPTPadministration a vehicle treated control b MPTP treated MPTP alongwith Indirubin 3 oxime5mg kg c 10mg kg d and30mg kg e Note Indirubin 3 oxime rescuedthe dopaminergieurons lossin a dose dependent manner c e 以JNK CDK5 GSK3 为明确靶点 以靛玉红衍生物为抑制剂 研发 出一类毒性小 特异性高 作用强的治疗PD的新药物1 筛选对JNK具 有特异性抑制作用的靛玉红衍生物 11个 2 筛选对黑质多巴胺神经 元凋亡具有保护性干预作用的靛玉红衍生物 8个 3 筛选对PD具有治 疗作用的衍生物 4个 4 药理 毒理研究1 首次证实JNK是治疗PD的 有效靶点2 证实GSK 3 是治疗PD的靶点之一3 发现靛玉红衍生物能够抑制JNK 对PD具有 治疗作用4 15篇相关SCI文章发表文章补充1 Wiedmann M Wang X Tang X Han M Li M Mao Z J NeurosciRes xxJun1 Epub aheadof print 2 Wang X Tang X Li M Marshall J Mao Z J BiolChem xx 280 17 16705 13 3 Li W Pi R Chan HH Fu H Lee NT Tsang HW Pu Y Chang DC Li C Luo J Xiong K Li Z Xue H Carlier PR Pang Y Tsim KW Li M Han Y J BiolChem xx 280 18 18179 88 创新点1 首次证实JNK是治疗PD的有效靶点2 证实GSK 3 是治疗PD的靶点之一3 发现靛玉红能够抑制JNK 对PD具有治疗作 用4 JNK CDK5 GSK 3 为靶治疗PD5 用一种化合物抑制JNK CDK5 GSK 3 我们对完成此项目充满信心 谢谢 Fig 6Mithramycin A a SP1 DNA bindinginhibitor attenuates bimupreguation by activity deprivation in CGNs A Mithramycin Aattenuates theupregulation ofBimEL induced by activity deprivationina dosedependent manner CGNs wereplaced in25K or5K mediaintheabsence orpresence ofmithramycin Aat theindicated concentrationsfor6h BimEL expressionwas assessedby Western blot as described in Fig 1 A Results shownare representativeof fourseparate experiments B Mithramycin Ainhibits theincrease inbim mRNAlevel inadose dependent manner Neurons weretreated asdescribed in A bim andactin mRNAswere determinedby RT PCR Results shownare representativeof fiveseparate experiments C Mithramycin Asuppresses theactivation ofbim promoterinducedbyactivitydeprivation Neurons wereco transfected withbim Luc andpEF RL for8hr Luciferase activitieswere measuredasdescribedinFig 2 The experimentswere repeatedthree timeswith duplicatesfor eachtreatment The datarepresent S E M of threeexperiments 参考文献1 Leyu Shi Shoufang Gong Zhongmin Yuan Chi Ma Yanling Liu Chuanfu Wang Wenming Li Rongbiao Pi Shoujian Huang Ruzhu Chen YifanHan Zixu Mao and MingtaoLi Activity deprivation dependent inductionoftheproapoptotic BH3 only proteinBim isindependent ofJNK c Jun activationduring apoptosisin cerebellargranuleneurons Neurosci Lett xx 375 7 12 2 Wenya Wang Leyu Shi Yuanbin Xie Chi Ma Wenming Li Xingwen Su Shoujian Huang Ruzhu Chen Zhenyu Zhu Zixu Mao YifanHanand MingtaoLi SP600125 a newJNK inhibitor protects dopaminergieurons inthe MPTPmodel ofParkinson s disease NeurosciResxx 48 195 2