代谢控制发酵复习

代谢控制发酵代谢控制发酵 第一章第一章绪论绪论 第二章第二章新陈代谢三大特点新陈代谢三大特点 条件温和 与酶催化和调控相关 反应有顺序 性 灵敏的自我调节功能 代谢控制发酵代谢控制发酵 利用遗传学的方法或其他生物化学的方法 人为的在脱氧核酸 核糖 DNA 的分子水平上 改变和控制微生物的代谢 使有用目的产物大量 生成 积累的发酵 代谢控制发酵有两种途径 思路 控制培养条件和控制 遗传型 第三章第三章代谢控制发酵的基本思想代谢控制发酵的基本思想 酶合成的调控 操纵子学说操纵子学说 酶反应终产物如何对酶的合成进行调控 6 页 按操纵子学说 操纵子由细胞中的操纵基因和邻近的几个结构基因组成 结构 基因能转录遗传信息 合成相应的 RNA mRNA 进而再翻译合成特定的酶 操纵基因能够控制结构基因作用的发挥 细胞中还有一种调节基因 嫩巩固产 生一种细胞质阻遏物 调节蛋白 细胞质阻遏物与阻遏物 通常是酶反应的终 产物 结合时 由于变构效应 结构改变和操纵基因亲和力变大 而使有关的 结构基因不能合成 mRNA 因此 酶合成受到阻遏 关键酶关键酶 是参与代谢调节的酶的总称 特点 1 关键酶并不都是分支点酶 2 生物合成途径越长 关键酶数目越多 3 不同微生物间的关键酶所受到调控不同 天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶 大肠杆菌中 3 种同功酶 苏氨酸 蛋氨酸 赖氨酸反馈抑制 谷氨酸棒杆菌中 受赖氨酸 苏氨酸协同反馈抑制 DAHP 合成酶合成酶 大肠杆菌中 3 种同功酶 酪氨酸 苯丙氨酸 色氨酸反馈抑制 变构酶变构酶 具有两个或两个以上结合部位的蛋白质 当其中一个部位与效应物 小分子物质 结合后 蛋白质构象发生改变 性能也随之变化 变构酶的作用程序变构酶的作用程序 专一性的代谢物 变构效应物 与酶蛋白表面的特定部位 变构部位 结合 酶分子的构象变化 变构转换 活性中心的修饰 抑制 或促进酶活性 动力学特点 动力学特点 3 个 个 1 S 形形 意味着存在底物及效应物对反应速度发生影响的阈值 2 3 脱敏作用脱敏作用 变构酶经特定处理后 不丧失酶活性而失去对变构效应物的敏感性 1 使变构酶解聚 加热 加尿素 汞盐 基因突变 2 诱变育得的抗类似 物突变株中多发生 调节中心的独立性 酶活力调节类型 酶活力调节类型 单功能途径 终产物抑制 代谢产物激活作用 前体激活 补偿激活 多功能途径 1 协作反馈抑制协作反馈抑制 多价反馈抑制 当一条代谢途径中有两个以上终产物时 两者同时过剩时 才能协同抑制第一个酶的活性 谷氨酸棒杆菌 黄色短杆菌等合成赖氨酸 苏氨酸 蛋氨酸途径中 与大肠杆 菌不同 天冬氨酸激酶不是同工酶 当三中任意种存在时不受抑制 在赖氨酸 和苏氨酸同时过量时 才发生反馈抑制 2 合作反馈抑制合作反馈抑制 当任何一个终产物单独过剩时 只部分的的抑制第一个酶的 活性 两者同时过量时 其抑制程度大于各自单独存在时的和 谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转氨酶 受 GMP IMP 等 6 羟基嘌呤核苷酸和 ADP AMP 等 6 氨基嘌呤核苷酸的反馈抑制 3 积累反馈抑制积累反馈抑制 每一个终产物只单独地 部分地抑制共同步骤第一个酶 并 且各最终产物的抑制作用互不影响 大肠杆菌的谷氨酰胺合成酶受 8 个总产 物的积累反馈抑制 4 顺序反馈抑制顺序反馈抑制 一种终产物的积累 导致前一中间产物的积累 通过后者反 馈抑制合成途径 关键酶的活性 使合成终止 枯草芽孢杆菌等微生物芳香族氨基酸的生物合成途径 5 同功酶同功酶 某一产物过量仅抑制相应酶活 对其他产物没有影响 大肠杆菌的天冬氨酸族氨基酸合成的调节 酶合成的调控 酶合成的调控 诱导的类型 同时诱导同时诱导 诱导物加入后 微生物能同时诱导出几种酶的合成 主要存在于短 的代谢途径中 顺序诱导顺序诱导 先合成能分解底物的酶 再合成分解各中间代谢物的酶达到对复杂 代谢途径的分段调节 1 协调阻遏 单功能生物合成途径中 终产物同时阻遏几个酶的合成 鼠伤寒沙门氏菌中的 3 个亮氨酸生物合成酶都受终产物亮氨酸的反馈阻遏 2 多价阻遏 通过几个终产物 共同协调活动 阻遏某一酶的生物合成 异亮氨酸 缬氨酸生物合成酶系为异亮氨酸 缬氨酸 亮氨酸 泛酸 3 积累阻遏 大肠杆菌的氨甲酰磷酸合成酶的合成 受嘧啶和精氨酸的部分的 阻遏 受尿嘧啶和精氨酸反馈阻遏的百分数 不管第二个阻遏物存在与否 都 是一样的 分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏 当细胞具有一优先利用底物 通常是 但并不总是葡萄糖 时 很多其他分解途径受到阻遏 实质实质 由于细胞内缺少了环腺甘酸 cAMP 大肠杆菌的分解代谢物阻遏作用机制作用机制 1 具有一个 CRP 基因编码一种调节蛋白 称为 cAMP 受体蛋白 CPR 或是 CAP 2 转录起始前 cAMP 须先与 CRP 结合成 CRP cAMP 复合物 再与启动基因 P 结合 3 cAMP 与 CRP 结合 使转录起始 CRP 起正作用 因而分解代谢物阻遏 4 细胞内的 cAMP 水平在某些方面反映出细胞内能量的状态 28 5 丧失腺苷酸环化酶的突变株 不能在受阻遏的碳源 甘油 乳糖 蔗糖 上 生长 但与 CRP 缺陷的突变株不同 外源性加入 cAMP 还是有效的 反馈阻遏和反馈抑制的的比较反馈阻遏和反馈抑制的的比较 30 页页 渗漏突变株的应用 渗漏突变株的应用 渗漏突变型 概念 指遗传性障碍不完全的缺陷型 解除菌体自身的反馈调节 解除菌体自身的反馈调节 1 选育抗腺嘌呤及鸟嘌呤结构类似物突变株 2 选育抗腺嘌呤或黄嘌呤突变株 3 选育抗磺胺类药物突变株 4 选育抗 ATP 结构类似物的抗生素的菌株 选育抗类似物突变株 酶特性的利用 营养缺陷型回复突变株的应用 选育抗类似物突变株 酶特性的利用 营养缺陷型回复突变株的应用 抗类似物突变株 抗类似物突变株 代谢拮抗物抗性突变株代谢拮抗物抗性突变株 是指一种对反馈抑制不敏感或对阻 遏有抗性的组成型突变株 或兼而有之的突变株 因为反馈抑制或阻遏 或两 者引起的自动调节作用已被削弱或解除 所以能合成较多的最终产物 34 页 为什么要用目的产物的结构类似物来选育抗类似物突变株 首先分析分析下代谢拮抗物的作用机理 正常的合成代谢的最终产物对于有关 酶的合成具有阻遏作用 对于合成途径的第一个酶具有反馈抑制作用 这是由 于它能与阻遏蛋白以及变构酶相结合的缘故 由于这种结合是可逆的 所以当 代谢最终产物例如某一氨基酸渗入蛋白质而在细胞中浓度降低时 它就不在与 阻遏物以及变构酶相结合 这时有关的酶的合成以及它们的催化作用便又可继 续进行 代谢拮抗物由于与代谢终产物结构相似 所以同样能与阻遏物以及变构酶相结 合 可是它们往往不能代替正常的氨基酸而合成为蛋白质 也就是说它们在细 胞中的浓度不会降低 因此与阻遏物以及变构酶的结合是不可逆 这使得有关 酶不可逆地停止了合成 或是酶的催化作用不可逆地被抑制 一个菌株是怎样会成为代谢拮抗物的抗性菌株 一个菌株是怎样会成为代谢拮抗物的抗性菌株 答案 一个可能的途径是变构酶结构基因变构酶结构基因发生突变 使变构酶调节部位不再能 与代谢拮抗物相结合 而其活性中心却不变 抗反馈突变型抗反馈突变型 另一个可能的途 径是调节基因调节基因 发生改变 使阻遏物不能再与代谢拮抗物结合 这种突变型也 将是一个代谢拮抗物的抗性突变株 同时也是一个抗阻遏突变型抗阻遏突变型 结构类似物抗性菌株和它们积累并分泌的代谢终产物 结构类似物抗性菌株和它们积累并分泌的代谢终产物 37 页 目标产物结构类似物 赖氨酸 S 2 氨基乙基 L 半胱氨酸 AEC 苏氨酸 氨基 羟基戊酸 AHV 精氨酸 D 精氨酸 苯丙氨酸对氟苯丙氨酸 选育精氨酸产生菌过程 选育精氨酸产生菌过程 39 页 页 精氨酸产生菌育种 谷氨酸棒杆菌抗结构类似物变异株 由于精氨酸的生物合成要受精氨酸本身的反馈抑制和反馈阻遏 要积累像精氨 酸这样非支路代谢途径构终产物 主要采用抗精氨酸类似物突变株 如 D 精氨 酸抗性 刀豆氨酸抗性突变株 以解除精氨酸自身的反馈调节 使精氨酸得以 积累 营养缺陷型营养缺陷型就是指原菌株由于发生基因突变 致使合成途径中某一步骤发生缺 陷 从而丧失了合成某些物质的能力 必须在培养基中外源补加该营养物质才 能生长的突变型菌株 营养缺陷型回复突变株的应用营养缺陷型回复突变株的应用有利用价值工业常用 因为当其中某一结构基因 发生突变后 该结构基因所编码的酶就因结构的改变而失活 而经过第二次突 变 回复突变 后 该酶的活性中心结构可以复原 而调节部位的结构常常没 有恢复 增加前体物的合成增加前体物的合成 1 切断除目的产物外的其他控制共用酶的终产物分支合成途径 2 设法解除目的产物自身合成的反馈调节外 也应设法解除对其前体物合成的 调节 3 因为在生物合成途径中分支点的分解途径的代谢流增强 使分支点处的中间 产物增多 导致目的产物的积累增加 4 利用基因工程技术 将生物合成途径中的关键酶基因克隆岛多拷贝载体上 使其大量扩增 从而也就增加了目的产物的前体合成 这是最直接的提高目 的的产物产量的方法 去除终产物去除终产物 改变细胞膜渗透性的方法 PPT 平衡合成的利用 平衡合成的利用 平衡合成 例子 现象判断 45 页 代谢互锁的利用代谢互锁的利用 代谢互锁 代谢互锁 从生物合成途径来看 似乎是受一种完全无关的终产物的控制 它 只是在较高浓度下才发生而且这种抑制 阻遏 作用是部分性的 不完全的 例子 45 页 温度敏感性突变 温度敏感性突变 通过诱变可以得到在低温下生长 而在高温下却不能生长繁 殖的突变株 代谢控制发酵的基本条件 代谢控制发酵的基本条件 菌种 培养基原料 环境 分离精致 营养缺陷型菌株的分离营养缺陷型菌株的分离 步骤 诱变处理 中间培养 淘汰野生型 缺陷型的检出和鉴定等步骤 梯度平板培养法 梯度平板培养法 即先在培养皿中加入 10ml 完全固体培养基 斜倾培养皿 使培养基刚好可以流到另一端 然后放平培养皿 再倒入 10ml 含有一定浓度 药物完全培养基 完全抑制野生型菌株生长的最低药物浓度平板 即为药物 梯度平板 抗药性突变株怎样选育 抗药性突变株怎样选育 72 能荷调节 概念能荷调节 概念 243 能荷 是一个表示细胞能量状态的参数 是细胞中所含腺苷酸中含有相当于 ATP 的数量百分比 脂代谢的调节以及与糖代谢的相互关系脂代谢的调节以及与糖代谢的相互关系 1 运送乙酰基 2 限速反应 3 能荷调节 ATP 水平 谷氨酸棒杆菌 黄色短杆菌等中的天冬氨酸族氨基酸的代谢调节机制主要包 括以下几个方面 290 1 关键酶 2 优先合成 3 代谢互锁 4 平衡合成 5 协同反馈抑制 赖氨酸发酵赖氨酸发酵 292 1 切断或减弱支路 2 解除反馈调节 3 解除代谢互锁 4 改善膜的通透性 5 增加前体物的合成 6 选育温度敏感突变株 合作终产物抑制合作终产物抑制 即使同时添加多种同类核苷酸 其抑制作用也不超过各同类核苷酸单独添加 时之和 但是果同时添加属于不同类型的两种嘌呤核苷酸 GMP AMP 或 IMP ADP 抑制作用就会相乘性的提高 核苷酸中常见 抗生素产生菌的几种主要代谢调节机制 抗生素产生菌的几种主要代谢调节机制 6 种 种 1 诱导调节 2 反馈调节 3 碳分解代谢产物调节 4 氮分解代谢产物调节 5 磷酸盐的调节 6 细胞膜透性的调节 青霉素发酵的代谢控制育种 青霉素发酵的代谢控制育种 411 一 青霉素和头孢霉素合成的调节方式 内酰胺类抗生素 同一的前体 半胱氨酸 缬氨酸 a 氨基已二酸以及苯乙酸 1 碳源分解代谢控制 关键酶 酰基转移酶 阻遏 2 赖氨酸的反馈调节 共同前体 3