热原和细菌内毒素

热原和细菌内毒素热原和细菌内毒素 一 热原一 热原 progon progon 医院临床在使用药品注射剂时 常有发生冷感 寒战 发热 头痛 恶心 呕吐 肤色灰白 休克 严重时导致死亡 这种症状称为热原反应 为提高药品质量和用药安全 人们对热原进行了广泛的研究 直到 1923 年 Seibert 提出了用家兔检测热原的方法 在 1942 年美国药典首先将家兔热原 检查项收入药典成为法定方法 中国药典 1953 年版开始收载该方法 随后的世 界各国药典都以动物热原检查法作为药品质量监测的方法之一 家兔热原检查法的优点 可在规定时间里观察到家兔的体温变化 相应反 应了热原质引起哺乳类动物复杂的体温反应过程 所以 在半个多世纪以来热 原检查法 为保障药品质量和用药安全发挥了重要作用 但随着制药工业的发展和临床用药的要求 该方法的局限性越来越明显 这种热原检查法 只局限于某种药物进入体内 血循环 是否能引起体温变化 或热原反应作为判断药品是否污染热原的方法 已不能满足医药工业发展的需 要 其缺点 标准化程度低 无法判断检查样品中存在的热原质到底是什么或是哪一 种物质 由于试验动物家兔是处在被细菌污染的环境中 通过吸入或皮肤感染细 菌内毒素而被免疫 导致动物的个体差异较大 试验动物受到药品的药理活性干扰 而影响体温变化 如放射性药品 抗生素 生物制品等 实验结果难以判断 设备及实验费用昂贵 如建设动物房 水电 动物饲料等耗费 做一 种药品需要 280 元 次 而鲎试剂仅 28 元 次 综上情况分析 鲎试验法可避免以上动物热原检查法的不足 该技术的成 功和应用真可谓是药品质量监控一场大革命 什么是热原 目前国内外仍未有统一的认识 但从国内外文献报道中 一 个共同的意见 都普遍认为 它是指细菌内毒素的脂多糖 欧洲药典委员会副主席 J Van Noordwijk 提出 严格地讲 不是每一种 热原都具有脂多糖的结构 但所有已知的细菌内毒素脂多糖都有热原活性 在药品生产质量管理规范 GMP 条件下 药品生产的质量控制一般可以接受的 观点是 不存在细菌内毒素意味着不存在热原 二 细菌内毒素 二 细菌内毒素 EndotoxinEndotoxin 细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖 Lipoply Saccharide 和微量蛋白 Protein 的复合物 它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物 而 是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质 其化学成 分广泛分布于革兰氏阴性菌 如大肠杆菌 布氏杆菌 伤寒杆菌 变形杆菌 沙门氏菌等 及其它微生物 如衣原体 立克次氏体 螺旋体等 的细胞壁层 的脂多糖 其化学成份主要是由 O 特异性链 核心多糖 类脂 A 三部分组成 O 特异性链 位于脂多糖分子最外层的多糖链 是由 3 5 个单糖 一般不多于 25 个 连成为一个多糖链 其单糖包括戊糖 氨基戊糖 已糖 氨基已糖 脱氧已糖等 单糖的种类 位置和排列顺序和空间构型 因菌种不 同而异 因此 它决定菌体热原的特异性 核心多糖 核心多糖的变异性较小 位于类脂 A 和 0 特异性链 内 层 之间 在结构上分为内核心和外核心 外核心含有数种己糖 包括葡萄糖 半乳糖 乙酰氨基葡萄糖等组成 内核心含有庚糖及特殊的酮糖 3 脱氧 D 甘 露糖 辛酮糖 KDO 这部分结构对不同菌株的 LPS 基本相似 而且 KDO 是以不 耐酸的酮糖链与类脂 A 的氨基葡萄糖连接 是构成内毒素脂多糖的核心部分 类脂 A 位于 LPS 分子结构的外层 是由氨基葡萄糖 磷酸和脂肪酸 10 18C 组成 故称之为糖磷脂 也是细菌外膜的一种 形成单体聚合物 具有疏水性 强 和亲水性 弱 的双相性 但是 类脂 A 可从 O 特异链及核 心多糖分离出来 游离的类脂 A 可自身凝聚成大分子的复合体而难溶于水 并 具有生物活性 所以 类脂 A Lipida 是内毒素多种生物活性或毒性反应的 主要基团 该基团没有种属特异性 所以各属细菌的类脂 A 结构相似 其毒性 反应相似 如发热 血液流动力学改变 弥漫性血管内凝血 并导致休克等 附图 2 由于类脂 A 有 4 条主链和 2 条支链的脂肪酸与内酰胺连接组成 所以提纯 的内毒素 LPS 是极为不稳定的 这就要求内毒素应在低温条件下保存 在工作 中内毒素稀释应尽可能地缩短时间 并要现配现用 三 内毒素的生物活性与疾病的相关性三 内毒素的生物活性与疾病的相关性 据文献报道 在很早期 约 19 世纪末 的意大利学者 Centanne 通过菌属 自溶的方法 从革兰氏阴性杆菌中提取出一种类似毒素的物质 因为这种物质 对动物体产生致热活性的同时 亦产生出一种病理学病性反应 而被命名为致 热毒素 Pyrotoxina 同时由德国的 Buchner 也从多种细菌中提取到相似的 致热毒素 并证实了这种毒素在导致白细胞数目的改变同时 具有增强机体对 细菌感染时的免疫能力 因此建立了 发热疗法 在美国纽约的临床医师 William B Coley 用加热法杀死录杆菌和化脓性 链球菌 将上清滤液用于各种恶性肿瘤 特别是肉瘤 的治疗 取得较好的疗 效 他将这种细菌上清液命名为 Coley 氏毒素 此后 murrayJ Shear 证实 Coley 氏毒素中具有抗肿瘤作用的物质为内毒素 直到 1933 年 Boivin 等学者在研究鼠伤寒杆菌的致病机理时 从鼠伤寒杆 菌中提取出内毒素 在 50 年代以后 对内毒素的化学成分和化学结构的研究得 到迅速发展 经过大量实验表明 内毒素具有极强的生物学活性 特别是革兰 氏阴性菌感染和静脉注射提取的内毒素溶液时 可导致动物体发生内毒素休克 和死亡 内毒素的致病机理 主要是由于革兰氏阴性杆菌 如大肠杆菌 沙门氏杆 菌 伤寒杆菌 布氏杆菌 变形杆菌金黄色葡萄球菌等 和其它微生物 病毒 立克次氏体 衣原体螺旋体等 感染时 这类菌属随病灶渗液进入血液循环 并扩散到各种组织器官和体液细胞内繁殖 这类菌属在体内死亡和解体后 才 稀放出大量的细菌内毒素脂多糖 LPS 据初步实验表明 当机体内毒素浓度 國值 0 005ng ml 时 可诱生内源性热原质如肿瘤坏死因子 白细胞介素和 2 干扰素等 这些因子刺激体温调节中枢导致机体发热 细菌内毒素直接或间 接作用于肝脏和胰腺时 可使肝细胞损伤 使糖原异生酶 如葡萄糖 6 6 磷 酸酶 糖原合成酶 的活性降低 抑制糖原的异生和分解 同时内毒素作用于 胰腺导致胰腺功能障碍 并形成胰岛素抵抗 造成血糖升高致使并发心肌炎和 心肌肿大的系列高血糖症状 所以 革兰氏阴性菌属感染或在病灶中的细菌进 入体液细胞繁殖 当其死亡或解体后产生的内毒素 可多次进入血液 引起反 复发作 其病理变化极为广泛 几乎所有的器官和组织都可被侵犯 而引起各 器官的功能障碍 其中以网状内皮系统最常见 淋巴 脾 肝 肾 骨髓中均 有上皮细胞增生 形成肉芽肿