生物技术综合试验终稿

生物技术综合试验生物技术综合试验 目的 目的 主要是通过本课程的学习 使学生受到严格的基因工程和分子生物学等技术实验 技能的训练 熟悉现代生物技术仪器的基本操作使用和应用范围 加深对生物技术系列相 关课程基本理论 基本技术原理的理解认识 实验一 质粒实验一 质粒 DNA 的小量提取的小量提取 实验二 双酶切反应实验二 双酶切反应 实验三 实验三 PET28 a 质粒载体的胶回收质粒载体的胶回收 实验四 引物设计实验四 引物设计 实验五 目的片段的实验五 目的片段的 PCR 扩增扩增 实验六 实验六 PCR 产物的双酶切反应产物的双酶切反应 实验七 实验七 PCR 产物的胶回收产物的胶回收 实验八 目的片段实验八 目的片段 OMP31 BLS 与与 PET28 a 载体的连接反应载体的连接反应 实验九 大肠杆菌感受态细胞的制备实验九 大肠杆菌感受态细胞的制备 实验十 重组质粒转化感受态细胞的实验实验十 重组质粒转化感受态细胞的实验 实验十一 菌落实验十一 菌落 PCR 反应反应 实验十二 实验十二 IPTG 诱导诱导 OMP31 和和 BLS 融合基因的表达融合基因的表达 实验十三 实验十三 SDS PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验一 质粒实验一 质粒 DNA 的小量提取的小量提取 一 目的要求 1 掌握用试剂盒提取质粒 DNA 的技术 2 掌握用分光光度计测定 DNA 浓度的方法 二 基本原理 在染色体外能自主复制且稳定遗产的遗传因子称为质粒 大小在 1kb 200kb 之间 是双链闭合环状的 DNA 分子 在细菌 放线菌 真菌以及一 些动植物细胞中都发现有质粒存在 其中细菌质粒存在最为普遍 在基因 工程中常用作基因载体 碱变性法又称碱抽提法或碱裂解法 是一种用的 最广泛的制备质粒 DNA 的方法 此法是基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的 变性与复性的差异而达到分离目的 在 pH 高达 12 6 的碱性条件下 染色 体 DNA 的氢键断裂 双螺旋结构解开而变性 质粒 DNA 的大部分氢键也 断裂 但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会分离 当以 pH4 8 的 NaAc 高盐缓冲液调节起 pH 至中性时 变性的质粒 DNA 又恢复原来的构型 保 存在溶液中 而染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构 通过离心 染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA 蛋白质 SDS 复合物等一起沉淀下 来而被除去 三 仪器 材料和试剂 1 仪器 微量移液器 微量离心管 又称 Eppendorf 管 常用玻璃器皿 台式高速离心机 分光光度计 2 材料 含有质粒的大肠杆菌 DH5a 3 试剂及溶液 LB 培养基 葡萄糖 质粒小提试剂盒 操作步骤 1 质粒 DNA 的提取 1 培养细菌 将带有质粒的单菌落 接种到 LB 液体培养基中 37oC 200r min 过夜震荡培养 2 柱平衡步骤 向吸附柱 CP3 中 吸附柱放入收集管中 加入 500ul 的平 衡液 BL 12000rpm 离心 1 分钟 倒掉收集管中的废液 将吸附柱重新放回 收集管中 请使用当天处理过的柱子 3 取过夜培养的细菌培养液 3mL 于 Eppendorf 管中 转速 12000r min 离心 1min 去掉上清夜 用滤纸吸干 4 向留有菌体沉淀的离心管中加入 250ul 溶液 P1 确保已加入 RNaseA 用枪头混匀 5 向离心管中加入 250 l 溶液 P2 温和上下翻转 6 8 次使菌体充分裂解 6 向离心管中加入 350 l 溶液 P3 立即温和上下翻转 6 8 次 充分混匀 此时将出现白色絮状沉淀 12000rpm 离心 10 分钟 此时在离心管底部形成沉 淀 7 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱 CP3 中 吸附柱放入收集 管中 尽量不要吸出沉淀 12000rmp 离心 30 60s 倒掉收集管中的废液 将吸附 柱 CP3 放入收集管中 8 向吸附柱 CP3 中加入 600ul 漂洗液 PW 加入无水乙醇 12000rmp 离心 30 60s 倒掉收集管中的废液 将吸附柱 CP3 放入收集管中 9 重复步骤 8 10 将吸附柱 CP3 放入收集管中 12000rmp 离心 2 分钟 目的是将吸附 柱中的残留的漂洗液去除 11 将吸附柱 CP3 置于一个干净的离心管中 向吸附膜中间部位滴加 50 100ul 洗脱缓冲液 EB 温室放置 2 分钟 12000rmp 离心 2 分钟将质粒溶液收集 到离心管中 2 用分光光度计测定质粒 DNA 的浓度 五 问题讨论 1 提取质粒 DNA 有多种方法 所有这些方法都包括 3 个基本步骤 培养细 胞使质粒扩增 收集和裂解细菌 分离和纯化质粒 DNA 可采用溶菌酶破坏 菌体细胞壁 SDS 十二烷基硫酸钠 可使细胞壁裂解 经溶菌酶和 SDS 处 理后 在碱性条件下细菌染色体 DNA 和质粒 DNA 都变性 而当加入乙酸钾 在中性条件下 巨大的染色体 DNA 分子难以复性 而质粒 DNA 很快得以复 性 离心时染色体 DNA 与细胞碎片一起被沉淀下来 而质粒 DNA 则留在上 清夜中 用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤 可得到质粒 DNA 2 利用核酸的紫外吸收测定核酸浓度的光学定量法 是定量 DNA RNA 常 用且快速的方法 组成核酸的五种碱基 G A T C U 均在 260nm 处 有强吸收峰 正是利用这一强吸收峰而对核酸进行定量的 碱基的种类不同 最大吸收波长以及吸光系数不同 即使是相同碱基 也会随 pH 的变化 吸 光系数也会产生变化 一般在中性附近进行测定 采用本法能够对纯度较好 的核酸进行准确定量 对纯度不高的样品 因为糖和蛋白质均具有紫外吸收 常会产生定量不准的结果 另外纯化核酸所用的试剂如苯酚 EDTA 等也有 紫外吸收 在定量时需注意 特别是苯酚有很强的吸收 用苯酚处理过的样 品定量时要特别的小心 核酸样品在 260nm 和 280nm 波长下均有一定的光吸 收值 如果比较纯的核酸样品 其 OD260 OD280是固定的 对 DNA 样品而言 其值大约为 1 8 2 2 如高于 2 2 则可能有 RNA 污染 低于 1 8 则有蛋白质污 染 因此可用测定样品 OD260 OD280的方法来分析核酸样品的纯度 六 试验结果 计算并记录你所提取的质粒 DNA 的浓度和纯度 实验二 双酶切反应实验二 双酶切反应 一 实验目的 1 掌握双酶切反应的基本原理 2 掌握双酶切反应获得质粒载体的基本方法 二 实验原理 DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切 限制性内切酶能特异地 结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上 并 切割双链DNA 它可分为三类 类 类 类 类和 类酶在同一蛋白质 分子中兼有切割和修饰 甲基化 作用且依赖于ATP的存在 类由两种酶组成 一种为限制性内切核酸酶 限制酶 它切割某一特异的核苷酸序列 另一种为独 立的甲基化酶 它修饰同一识别序列 类中的限制性内切酶在分子克隆中得到 了广泛应用 它们是重组DNA的基础 绝大多数 类限制酶识别长度为4至6个 核苷酸的回文对称特异核苷酸序列 DNA纯度 缓冲液 温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切 酶的活性 大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响 当微量的污染物 进入限制性内切酶贮存液中时 会影响其进一步使用 因此在吸取限制性内切酶时 每 次都要用新的吸管头 如果采用两种限制性内切酶 必须要注意分别提供各自的 最适盐浓度 若两者可用同一缓冲液 则可同时水解 若需要不同的盐浓度 则低 盐浓度的限制性内切酶必须首先使用 随后调节盐浓度 再用高盐浓度的限制性内 切酶水解 也可在第一个酶切反应完成后 用等体积酚 氯仿抽提 加0 1倍体积 3mol L NaAc和2倍体积无水乙醇 混匀后置 70 低温冰箱30分钟 离心 干燥 并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应 三 实验材料及试剂 实验材料 实验一获得的 PET28a 质粒载体 实验试剂 EcoR I Xho I 10 x Hbuffer 灭菌水 冰 37 水浴 四 双酶切反应体系 20 L H buffer 10 x 2 L1 L EcoR I1 L0 5 L Xho I1 L0 5 L DNA4 L5 L ddH2O12 L3 L Total20 L10 L 五 实验步骤 1 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管 最好0 5ml 编号 用微量移液枪按照体积 由大到小的顺序加入上述溶液 再加入重蒸水使总体积为18 l 2 将管内溶液混匀后加入2 l酶液 用手指轻弹管壁使溶液混匀 也可用微量离心 机甩一下 使溶液集中在管底 此步操作是整个实验成败的关键 要防止错加 漏 加 使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间 以免活性降低 3 混匀反应体系后 将eppendorf管置于适当的支持物上 如插在泡沫塑料板上 37 水浴保温2 3小时 使酶切反应完全 4 每管加入2 l 0 1mol L EDTA pH8 0 混匀 以停止反应 置于冰箱中保存备用 注 将加好的反应体系放入 37 恒温水浴锅中反应 如果是载体 则反映时间 为 5 6h 如果是 DNA 则反应时间是 1 2h 附 A B C BamH I Hind 1xK EcoR I Hind 1xm EcoR IBamH I1xK BamH IXho I1xK Hind Xho I1xm 实验三 实验三 PET28 a 质粒载体的胶回收质粒载体的胶回收 一 实验目的 1 掌握琼脂糖凝胶的制备方法 2 掌握琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 的方法 3 掌握 DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒的使用 二 实验原理 根据 DNA 分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应 达到分离混合物的目 的 DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电 在电场中向阳极移动 在一定 的电场强度下 DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应 即分子本身的大小和 构型是主要的影响因素 DNA 分子的迁移速度与其相对分子量成反比 电泳过程中或电泳完毕 直接利用低浓度的荧光染料 EB 溴化乙锭 进行 染色 EB 可以嵌入核酸双链的配对碱基当中 在紫外激发下 发出荧光 即可 确定 DNA 条带在凝胶中的位置而且灵敏度很高 少知 1 10ng 的 DNA 条带即 可直接在紫外灯下检出 不同浓度的琼脂糖凝胶的分离范围 凝胶中的琼脂糖含量 线状 DNA 分子的有效分离范围 Kb 0 35 60 0 61 20 0 70 8 10 0 90 5 7 0 1 20 4 6 0 1 50 2 3 0 2 00 1 2 0 琼脂糖凝胶电泳后 用 DNA 凝胶试剂盒回收酶切产物 试剂盒中有一个 特制的 Column 将硅胶填制到这个特制的管中 利用硅胶在高盐低 PH 下吸附 DNA 在低盐和高 PH 的条件下 DNA 可以再次被洗脱的原理 进行 DNA 的回收 和纯化 三 主要实验仪器和试剂 主要仪器 电泳仪 电泳槽 凝胶成像系统 水浴锅 微波炉 离心机等 主要实验试剂 1 50 TAE 2 M Tris 1M 醋酸 50 mM EDTA pH8 0 2 10 上样缓冲液 loading buffer 3 分子量标准 DNA Marker 4 琼脂糖 5 EB 溴化乙锭 黑暗保存 6 DNA 回收纯化试剂盒 AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒 四 实验步骤 琼脂糖凝胶的制备 1 将洗净的电泳槽洗净 置于平整的台面上 并调节水平 2 用 1 TAE 电泳缓冲液配制 0 8 的琼脂糖 微波炉加热使其溶解 3 待琼脂糖溶液冷却至 60 C 左右时 缓缓将琼脂糖倒入胶模中 厚度 约 5 至 7mm 4 插入梳子 静待琼脂糖凝固 5 将胶模放进电泳槽中 向电泳槽倒入 1 TAE 电泳缓冲液 没过胶约 5mm 6 小心拔掉梳子 用 20 ul 移液器吸取 DNA 溶液 20 ul DNA 加 2 3ul 10 loading buffer 缓缓加入点样孔 并在最右边的点样孔加 6 ul DNA Maker 7 接通电源 注意电源的正负极 电泳至条带前缘到达胶的 2 3 左 右 约 20 30 分钟 8 电泳完毕 关闭电源 从胶模中取出琼脂糖凝胶 放入 EB 染色液中 染色 6 8min 然后置于紫外灯下观察 酶切产物凝胶回收 1 在紫外灯下切下含有目的 DNA 的琼脂糖凝胶 计算凝胶重量 100mg 凝胶 计 100ul 体积 尽量缩短暴露 UV 灯下的时间 2 加入 3 个凝胶体积的 Buffer DE A 600 ul 混合均匀后 于 65 C 加热 直至凝胶完全熔化 3 加 0 5 个 Buffer DE A 体积的 Buffer DE B 300 ul 混合均匀 当分 离的 DNA 片段小于 400 bp 时 加入 1 个凝胶体积的异丙醇 4 吸取 3 中的混合液 转移到 DNA 制备管 置于 2 ml 离心管中 12000r min 离心 1 min 弃滤液 5 将制备管置回 2 ml 离心管中 加 500 ul Buffer W1 12000r min 离心 30 sec 弃滤液 6 将制备管置回 2 ml 离心管中 加 700 ul Buffer W2 12000r min 离心 30 sec 弃滤液 重复一次 7 将制备管置回 2 ml 离心管中 12000r min 离心 1 min 彻底去除残余 的液体 8 将制备管置于 1 5 ml 离心管中 在制备膜中央 加 25 30 ul 65 C Eluent 或去离子水 室温静置 1 min 12000r min 离心 1 min 洗脱 DNA 五 思考题 1 如何有效提高凝胶纯化 PCR 产物的效率 2 琼脂糖凝胶电泳中 DNA 分子迁移率受哪些因素的影响 实验四 引物设计实验四 引物设计 一 实验目的 掌握引物设计的方法和原理 二 实验步骤 1 在 NCBI 上搜索到目的基因 找到该基因的 mRNA 在 CDS 选项中 找到 编码区所在位置 在下面的 origin 中 Copy 该编码序列作为软件查询序列的候 选对象 2 用 Primer Premier5 搜索引物 打开 Primer Premier5 点击 File New DNA sequence 出现输入序列窗 口 Copy 目的序列在输入框内 选择 As 此窗口内 序列也可以直接翻译 成蛋白 点击 Primer 进入引物窗口 此窗口可以链接到 引物搜索 引物编辑 以及 搜索结果 选项 点击 Search 按钮 进入引物搜索框 选择 PCR primers Pairs 设 定搜索区域和引物长度和产物长度 在 Search Parameters 里面 可以设定相 应参数 一般若无特殊需要 参数选择默认即可 但产物长度可以适当变化 因为 100 200bp 的产物电泳跑得较散 所以可以选择 300 500bp 点击 OK 软件即开始自动搜索引物 搜索完成后 会自动跳出结果窗 口 搜索结果默认按照评分 Rating 排序 点击其中任一个搜索结果 可以 在 引物窗口 中 显示出该引物的综合情况 包括上游引物和下游引物的序 列和位置 引物的各种信息等 对于引物的序列 可以简单查看一下 避免出现下列情况 3 不要出 现连续的 3 个碱基相连的情况 比如 GGG 或 CCC 否则容易引起错配 此窗 口中需要着重查看的包括 Tm 应该在 55 70 度之间 GC 应该在 45 55 间 上游引物和下游引物的 Tm 值最好不要相差太多 大概在 2 度 以下较好 该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息 包括 发卡 二 聚体 引物间交叉二聚体和错误引发位置 若按钮显示为红色 表示存在该二 级结构 点击该红色按钮 即可看到相应二级结构位置图示 最理想的引物 应该都不存在这些二级结构 即这几个按钮都显示为 None 为好 但有时很 难找到各个条件都满足的引物 所以要求可以适当放宽 比如引物存在错配的 话 可以就具体情况考察该错配的效率如何 是否会明显影响产物 对于引物 具体详细的评价需要借助于 Oligo 来完成 Oligo 自身虽然带有引物搜索功能 但其搜索出的引物质量感觉不如 Primer5 在 Primer5 窗口中 若觉得某一对引物合适 可以在搜索结果窗口中 点击该引物 然后在菜单栏 选择 File Print Current pair 使用 PDF 虚拟打印 机 即可转换为 Pdf 文档 里面有该引物的详细信息 3 用 Oligo 验证评估引物 在 Oligo 软件界面 File 菜单下 选择 Open 定位到目的 cDNA 序列 在 primer 中 该序列已经被保存为 Seq 文件 会跳出来两个窗口 分别 为 Internal Stability Delta G 窗口和 Tm 窗口 在 Tm 窗口中 点击最左下 角的按钮 会出来引物定位对话框 输入候选的上游引物序列位置 Primer5 已经给出 即可 而引物长度可以通过点击 Change Current oligo length 来 改变 定位后 点击 Tm 窗口的 Upper 按钮 确定上游引物 同样方法定位下 游引物位置 点击 Lower 按钮 确定下游引物 引物确定后 即可以充分利用 Analyze 菜单中各种强大的引物分析功能了 Analyze 中 第一项为 Key info 点击 Selected primers 会给出两条引 物的概括性信息 其中包括引物的 Tm 值 此值 Oligo 是采用 nearest neighbor method 计算 会比 Primer5 中引物的 Tm 值略高 此窗口中还给出引物的 Delta G 和 3 端的 Delta G 3 端的 Delta G 过高 会在错配位点形成双链结 构并引起 DNA 聚合反应 因此此项绝对值应该小一些 最好不要超过 9 Analyze 中第二项为 Duplex Formation 即二聚体形成分析 可以选择 上游引物或下游引物 分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体 情况 还可以选择 Upper Lower 即上下游引物之间的二聚体形成情况 引物 二聚体是影响 PCR 反应异常的重要因素 因此应该避免设计的引物存在二聚 体 至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的 即其 Delta G 值应该偏 低 一般不要使其超过 4 5kcal mol 结合碱基对不要超过 3 个 Oligo 此项的 分析窗口中分别给出了 3 端和整个引物的二聚体图示和 Delta G 值 Analyze 中第三项为 Hairpin Formation 即发夹结构分析 可以选择上 游或者下游引物 同样 Delta G 值不要超过 4 5kcal mol 碱基对不要超过 3 个 Analyze 中第四项为 Composition and Tm 会给出上游引物 下游引物和产物 的各个碱基的组成比例和 Tm 值 上下游引物的 GC 需要控制在 40 60 而且上下游引物之间的 GC 不要相差太大 Tm 值共有 3 个 分别采用三种方法计算出来 包括 nearest neighbor method GC method 和 2 A T 4 G C method 最后一种应该是 Primer5 所采用的方法 Tm 值可以控制在 50 70 度之间 第五项为 False Priming Sites 即错误引发位点 在 Primer5 中虽然也有 False priming 分析 但不如 oligo 详细 并且 oligo 会给我正确引发效率和错误 引发效率 一般的原则要使误引发效率在 100 以下 当然有时候正确位点的引 发效率很高的话 比如达到 400 500 错误引发效率超过 100 幅度若不大的 话 也可以接受 Analyze 中 有参考价值的最后一项是 PCR 在此窗口中 是基于 此对引物的 PCR 反应 Summary 并且给出了此反应的最佳退火温度 另外 提供了对于此对引物的简短评价 若该引物有不利于 PCR 反应的二级结构存 在 并且 Delta G 值偏大的话 Oligo 在最后的评价中会注明 若没有注明此项 表明二级结构能值较小 基本可以接受 引物评价完毕后 可以选择 File Print 打印为 PDF 文件保存 文件中 将会包括所有 Oligo 软件中已经打开的窗口所包括的信息 多达数页 因此 打印前最好关掉 Tm 窗口和 Delta G 窗口 可以保留引物信息窗口 二级结构 分析窗口 若存在可疑的异常的话 和 PCR 窗口 4 引物确定后 对于上游和下游引物分别进行 Blast 分析 一般来说 多少都 会找到一些其他基因的同源序列 此时 可以对上游引物和下游引物的 blast 结果进行对比分析 只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以 三 注意事项 1 引物的长度一般为 15 30 bp 常用的是 18 27 bp 但不应大于 38 因为 过长会导致其延伸温度大于 74 不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应 2 引物序列在模板内应当没有相似性较高 尤其是 3 端相似性较高的序列 否则容易导致错配 引物 3 端出现 3 个以上的连续碱基 如 GGG 或 CCC 也 会使错误引发机率增加 3 引物 3 端的末位碱基对 Taq 酶的 DNA 合成效率有较大的影响 不同的 末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率 末位碱基为 A 的错配效率明显高于 其他 3 个碱基 因此应当避免在引物的 3 端使用碱基 A 另外 引物二聚体或 发夹结构也可能导致 PCR 反应失败 5 端序列对 PCR 影响不太大 因此常用 来引进修饰位点或标记物 4 引物序列的 GC 含量一般为 40 60 过高或过低都不利于引发反应 上 下游引物的 GC 含量不能相差太大 5 尽可能使用两条引物的 Tm 值相同 最好相差不要超过 5 退火温 度根据较低的 Tm 值选定 也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火 温度 引物所对应模板位置序列的 Tm 值在 72 左右可使复性条件最佳 Tm 值的计算有多种方法 如按公式 Tm 4 G C 2 A T 在 Oligo 软件中使用的 是最邻近法 the nearest neighbor method 6 G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能 该值反映了双链结构内部碱基 对的相对稳定性 应当选用 3 端 G 值较低 绝对值不超过 9 而 5 端和中 间 G 值相对较高的引物 引物的 3 端的 G 值过高 容易在错配位点形成双 链结构并引发 DNA 聚合反应 7 引物二聚体及发夹结构的能值过高 超过 4 5kcal mol 易导致产生引物 二聚体带 并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能正常进行 8 对引物的修饰一般是在 5 端增加酶切位点 应根据下一步实验中要插入 PCR 产物的载体的相应序列而确定 9 引物序列应该都是写成 5 3 方向的 Tm 之间的差异最好控制在 2 度之内 10 密码子的简并 如扩增编码区域 引物 3 端不要终止于密码子的第 3 位 因密码子的第 3 位易发生简并 会影响扩增特异性与效率 实验五 聚合酶链式反应 实验五 聚合酶链式反应 PCR 一 实验目的 1 学习并掌握 PCR 基因扩增的操作方法 2 理解 PCR 基因扩增技术在 DNA 操作中的重要性 二 实验原理 设计出一对寡聚核苷酸引物可与目的 DNA 分子互补 以至于能被 DNA 聚合 酶相向延伸 那么被该引物结合的摸板区就可通过变性 退火和聚合的循环来 大量扩增 这一过程被称为聚合酶链式反应 该技术 1985 年由 Mullis 及同事 们设计并研究成功 其原理类似于 DNA 的天然复制过程 是将待扩增的 DNA 片 段和与其两侧互补的寡聚核苷酸引物经过变性 退火和延伸若干个循环后 DNA 扩增倍数可达 2n倍 该技术已成为分子生物学中一种有助于 DNA 克隆及基因分 析的必须工具 PCR 的工作程序如下 在第一个循环中 目的 DNA 在加热至 95 60s 左右 的条件下分成两条单链 当降温至 55 约 30s 左右时 引物首先与模板杂 交复性 退火后温度再升至 72 60s 90s 以进行聚合反应 聚合反应要消 耗反应混合物中的 dNTPs 并需要 Mg2 第一次聚合反应中不同的目标分子从 引物 3 末端开始扩增 不断对目标分子进行拷贝 新合成分子的长度可以各 不相同 当温度再次升高到 95 变性所有新合成分子的第二次循环开始 每一对 PCR 引物长度约为 18 30 个核苷酸 并且成对引物间的 G C 含量应 相似 以致使它们在相近的温度下与其互补序列结合 短的寡核苷酸的退火温 度可用下列公式计算 Tm 2 A T 4 G C 引物与目的序列的相应链退火 结果可通过向 3 端加核苷酸相向延伸 较短的片段较易扩增 三 实验材料及试剂 1 模板 DNA 含有 OMP31 和 BLS 基因的 PET28a 质粒载体 2 对应目的基因的特异引物 3 10 PCR Buffer 4 2mM dNTPmix 含 dATP dCTP dGTP dTTP 各 2mM 5 Taq 酶 四 操作步骤 1 在冰浴中 按以下次序将各成分加入一无菌 0 5ml 离心管中 10 PCR buffer 2 5 l dNTP mix 2mM 2 l 引物 1 10pM 1 l 引物 2 10pM 1 l Taq 酶 2U l 0 5 l DNA 模板 50ng 1 g l 0 5 l 加 ddH2O 至 25 l 2 调整好反应程序 将上述混合液稍加离心 立即置 PCR 仪上 执行扩增 程 序 在 93 预变性 3 5min 进入循环扩增阶段 93 40s 58 30s 72 60s 循环 30 次 最后在 72 保温 7min 3 结束反应 PCR 产物放置于 4 待电泳检测或 20 长期保存 五 PCR 反应体系的组成与反应条件的优化 PCR 反应体系由反应缓冲液 10 PCR Buffer 脱氧核苷三磷酸底物 dNTPmix 耐热 DNA 聚合酶 Taq 酶 寡聚核苷酸引物 Primer1 Primer2 靶序列 DNA 模板 五部分组成 各个组份都能影响 PCR 结果的好坏 1 反应缓冲液 一般随 Taq DNA 聚合酶供应 标准缓冲液含 50mM KCl 10mM Tris HCl pH8 3 室温 1 5mM MgCl2 Mg2 的浓度对反应的特异 性及产量有着显著影响 浓度过高 使反应特异性降低 浓度过低 使产物减 少 在各种单核苷酸浓度为 200 M 时 Mg2 为 1 5mM 较合适 若样品中含 EDTA 或其它螯合物 可适当增加 Mg2 的浓度 在高浓度 DNA 及 dNTP 条件下进 行反应时 也必须相应调节 Mg2 的浓度 据经验 一般以 1 5 2mM 终浓度 较好 2 dNTP 高浓度 dNTP 易产生错误掺入 过高则可能不扩增 但浓度过低 将降低反应产物的产量 PCR 中常用终浓度为 50 400 M 的 dNTP 四种脱氧三 磷酸核苷酸的浓度应相同 如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时 偏高或偏低 就会诱发聚合酶的错误掺入作用 降低合成速度 过早终止延 伸反应 此外 dNTP 能与 Mg2 结合 使游离的 Mg2 浓度降低 因此 dNTP 的 浓度直接影响到反应中起重要作用的 Mg2 浓度 3 Taq DNA 聚合酶酶 在 100 l 反应体系中 一般加入 2 4U 的酶量 足 以达到每 min 延伸 1000 4000 个核苷酸的掺入速度 酶量过多将导致产生非特 异性产物 但是 不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异 由于酶的浓 度对 PCR 反应影响极大 因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度 当降低反 应体积时 如 20 l 或 50 l 一般酶的用量仍不小于 2U 否则反应效率将降 低 4 引物 引物是决定 PCR 结果的关键 引物设计在 PCR 反应中极为重要 要保证 PCR 反应能准确 特异 有效地对模板 DNA 进行扩增 通常引物设计要 遵循以下几条原则 引物的长度以 15 30bp 为宜 一般 G C 的含量在 45 55 Tm 值高于 55 Tm 4 G C 2 A T 应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列 碱基的分 布应表现出是随机的 引物的 3 端不应与引物内部有互补 避免引物内部形成二级结构 两 个引物在 3 端不应出现同源性 以免形成引物二聚体 3 端末位碱基在很大 程度上影响着 Taq 酶的延伸效率 两条引物间配对碱基数少于 5 个 引物自身 配对若形成茎环结构 茎的碱基对数不能超过 3 个由于影响引物设计的因素比 较多 现常常利用计算机辅助设计 人工合成的寡聚核苷酸引物需经 PAGE 或离子交换 HPLC 进行纯化 引物浓度不宜偏高 浓度过高有两个弊端 一是容易形成引物二聚体 primer dimer 二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时 容易产生 非特异性产物 一般说来 用低浓度引物不仅经济 而且反应特异性也较好 一般用 0 25 0 5pM l 较好 引物一般用 TE 配制成较高浓度的母液 约 100 M 保存于 20 使 用前取出其中一部分用 ddH2O 配制成 10 M 或 20 M 的工作液 5 模板 PCR 对模板的要求不高 单 双链 DNA 均可作为 PCR 的样品 虽然 PCR 可以用极微量的样品 甚至是来自单一细胞的 DNA 作为摸板 但为 了保证反应的特异性 一般还宜用 g 水平的基因组 DNA 或 104 拷贝的待扩增 片段作为起始材料 原材料可以是粗制品 某些材料甚至仅需用溶剂一步提取 之后即可用于扩增 但混有任何蛋白酶 核酸酶 Taq DNA 聚合酶抑制剂以及 能结合 DNA 的蛋白 将可能干扰 PCR 反应 6 PCR 循环加快 即相对减少变性 复性 延伸的时间 可增加产物的特 异性 四 注意事项 1 PCR 反应应该在一个没有 DNA 污染的干净环境中进行 最好设立一个 专用的 PCR 实验室 2 纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响 一般而言 只要能够 得到可靠的结果 纯化的方法越简单越好 3 所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染 操作过程中均应戴手套 4 PCR 试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水 采用 0 22 m 滤膜过滤除 菌或高压灭菌 5 试剂都应该以大体积配制 试验一下是否满意 然后分装成仅够一次使 用的量储存 从而确保实验与实验之间的连续性 6 试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子 玻璃器皿 应洗涤干净并高压灭菌 7 PCR 的样品应在冰浴上化开 并且要充分混匀 实验六 实验六 PCR 产物的双酶切反应 同实验二 产物的双酶切反应 同实验二 实验七 实验七 PCR 产物的胶回收 同实验三 产物的胶回收 同实验三 实验八 目的片段实验八 目的片段 OMP31 BLS 与与 PET28 a 载体的连接载体的连接 反应反应 一 实验目的 掌握酶连反应的条件 原理 二 实验材料及试剂 实验材料 实验三得到的 PET28a 质粒载体 实验七得到的目的片段 Omp31和 Bls 实验试剂 T4DNA ligase 10 xT4Buffer ATP 灭菌水 三 酶连体系 10 xT4 Buffer1 0 L 目的 DNA 片段1 0 L 载体1 0 L T4DNA ligase0 5 L ddH2O6 5 L Total10 L 将加好的反应体系混匀后 放入 16 金属浴中连接 3h 实验九 大肠杆菌感受态细胞的制备实验九 大肠杆菌感受态细胞的制备 一 实验目的 学习氯化钙法制备大肠杆菌 BL21 DE 3感受态细胞 二 实验原理 人们发现用含 Ca2 的溶液处理的大肠杆菌细胞会易于吸收外源 DNA 这一 过程被称为转化 转化过程所用的受体细胞一般是限制 修饰系统缺陷的变 异株 即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株 常用 R M 表示 受体细 胞经过一些特殊方法 如电击法 CaCl2 RuCl 等化学试剂法 的处理后 细 胞膜的通透性发生变化 成为能允许许多有外源 DNA 的载体分子通过的感受 态细胞 在一定条件下 将带有外源 DNA 的载体分子与感受态细胞混合保温 使载体 DNA 分子进入受体细胞 进入细胞的 DNA 分子通过复制 表达实现遗 传信息的转移 使受体细胞出现新的遗传性状 三 仪器 材料和试剂 1 仪器和材料 恒温摇床 电热恒温培养箱 超净台 分光光度计 台式 离心机 离心管 大肠杆菌 BL21 DE 3 2 试剂 1 基本培养基 在三角瓶中 将 15 克琼脂与 725mL 水混合并高压灭菌 待冷却至 55 在到培养皿之前向琼脂溶液中加入 250mL 灭过菌的 4 倍盐溶 液 2mL 灭过菌的 1moL L 的 MgSO4 2mL 灭过菌的 50mmoL L CaCl2 20mL 灭 过菌的 10 葡萄糖以及 2mL 灭过菌的 10mg mL 维生素 B1 过滤除菌 4 倍 盐溶液 6g Na2HPO4 3g KH2PO4 0 5gNaCl 1g NH4Cl 加水至 250mL 并调 pH 至 7 4 2 LB 培养基 1L 将 10g 胰蛋白胨 5g 酵母提取物及 5gNaCl 溶于 1L 水中并高压灭菌 若要配置含卡那霉素的 LB 培养基 则将 15 克琼脂加 1L LB 培养液中高压灭菌 待冷却至 55 向其中加入 1 5mL100mg ml 的卡那霉 素 3 0 1mol LMgCl2和 0 1mol LCaCl2 含 20 甘油 两者均调 pH 值至 7 2 并 高压灭菌备用 四 操作步骤 氯化钙法 a 用划线培养法将大肠杆菌接种于基本培养基平皿上 于 37 倒置培养 1d 2d b 将单个菌落接种于 10mL LB 培养液的试管中 37 振荡 200r min 培 养过夜 c 向两个装有 200mLLB 培养液的 500mL 三角瓶中各加入 4mL 过夜培养细胞 37 振荡培养至光密度 OD600 值在 0 5 0 6 之间 约需 1h 2h d 将每份细菌培养物分别倒入一个预先冰浴的无菌 250mL 离心瓶并置于冰 上保持 20min 于 4 下离心 10min 8000r min 弃去上清夜 e 将每份沉淀轻缓的悬于 100mL 冰冷的 0 1mol L MgCl2 Ph7 2 溶液中 按上述方法再次离心 f 去上清夜 并将每一份沉淀轻缓的悬浮于 20mL 冰冷的含 20 甘油的 0 1 mol L CaCl2 Ph7 2 溶液中 g 分装于微量离心管中 每支 1mL 80 储存备用 注意 1 为了获得高感受态细胞 应选用处于生长对数期的细胞 OD600值不应高 于 0 6 并且在整个试验过程中均需将细胞置于冰上 2 细胞在冰冻后即获得了感受性 在 80 几小时后感受性达到最高值 几个月内均能维持高水平的感受态 五 讨论 1 试剂的质量与污染 所用的试剂如 CaCl2等应是高质量的 且最好保存于干 燥的暗凉处 整个过程需要注意防止杂菌和其他 DNA 的污染 所用器皿如离 心管 分装用的微量离心管等一定要洗干净 最好用新的 并在整个过程中 要无菌操作 少量其他试剂在器皿中残留或 DNA 的污染均会影响转化率 实 验中凡涉及溶液的移取 分装等敞开实验器皿的操作 最好在无菌超净台中 进行以防污染 六 结果分析 实验十 目的基因转化感受态细胞的实验实验十 目的基因转化感受态细胞的实验 一 实验目的 1 了解细胞转化的过程及其在分子生物学研究中的意义 2 外源质粒 DNA 转入受体菌感受态细胞并筛选转化体的方法 二 实验原理 连接反应中形成的重组子及其他质粒分子的混合体必须通过转入宿主 细胞将它们相互分离进而复制 克隆 人们发现用含 Ca2 的溶液处理的大肠 杆菌细胞会易于吸收外源 DNA 这一过程被称为转化 transformation 将 转化后的细胞在选择性培养基中培养 即可筛选出转化体 transformation 即 可能带有异源 DNA 分子的重组细胞 大肠杆菌的转化过程是将质粒分子溶液 或连接反应的混合物与感受态细胞的悬浮液混合放置 将混合溶液于 42 热处理 1min 2min 一般 90s 会诱导质粒 DNA 分子进入细胞 提高转化效 率 然后加适量生长培养基液于转化细胞 并在室温下培养 最终涂布于琼脂 平板表面 培养至形成细菌单菌落 同一克隆中的所有细胞均起源于某一单 独个体的分裂繁殖 因此所有细胞具相同的基因型 这里不包括自发突变 只 包括转化步骤中引入的质粒 换言之 即是克隆或克隆群 在单一亚克隆实验中 要求实验设计应充分体现重组子克隆的产率 例 如可采用碱性磷酸酶处理载体 通常的筛选方法是分别从若干克隆中制备质 粒 DNA 然后用琼脂糖电泳进行分析 本实验以 E coli BL21 DE 3菌株为受 体细胞 用 CaCl2处理受体菌使其处于感受态 然后 PET28a 质粒共保温实现 转化 PET28a 质粒带有卡那霉素抗性基因的特性 将经过转化的全部受体 细胞进行适当修饰 在含卡那霉素的平板培养基上培养 只有转化体才能存 活 而未受转化的受体细胞则因无抵抗卡那霉素的能力而死亡 转化体经扩 增后 可将转入的质粒 DNA 分离提取出来 用于电泳分析 限制型内切酶图谱 的制作以及 DNA 测序等实验 三 仪器 材料和试剂 1 仪器和材料 恒温摇床 电热恒温培养箱 超净台 分光光度计 台 式离心机 离心管 大肠杆菌 BL21 DE 3 PET28a 质粒 DNA Eppendorf 管 移液器 液氮 2 试剂 1 基本培养基 在三角瓶中 将 15 克琼脂与 725mL 水混合并高压灭 菌 待冷却至 55 在到培养皿之前向琼脂溶液中加入 250mL 灭过菌的 4 倍 盐溶液 2mL 灭过菌的 1moL L 的 MgSO4 2mL 灭过菌的 50mmoL L CaCl2 20mL 灭过菌的 10 葡萄糖以及 2mL 灭过菌的 10mg mL 维生素 B1 过 滤除菌 4 倍盐溶液 6g Na2HPO4 3g KH2PO4 0 5gNaCl 1g NH4Cl 加水至 250mL 并 调 pH 至 7 4 2 LB 培养基 1L 将 10g 胰蛋白胨 5g 酵母提取物及 5gNaCl 溶于 1L 水中并高压灭菌 若要配置含氨卞青霉素的 LB 培养基 则将 15 克琼脂 加 1L LB 培养液中高压灭菌 待冷却至 55 向其中加入 1 5mL100mg ml 的 氨卞青霉素 3 0 1mol LMgCl2和 0 1mol LCaCl2 含 20 甘油 两者均调 pH 值至 7 2 并高压灭菌备用 4 TSS 溶液 10 PEG 8000 5 DMSO 20mmol L MgSO4 以上各成分溶于 100mLLB 培养液中 过滤除菌 由于高压灭菌会使 TSS 液转化效果下降 PEG 可 以单独进行高压灭菌 四 操作步骤 1 氯化钙法制备的感受态细胞的转化 1 将 1ng 10ng 质粒 DNA 加于 1 5mL 无菌离心管中 再用缓冲液 Tris10mmol L pH7 7 0 1mmol L EDTA 将体积调至 100mL 置于冰上 2 待感受态细胞在冰上融化后 向含有质粒 DNA 的离心管中加入 200 L 混 匀并在冰上静置 30min 3 将离心管放入 42 水浴中 90s 对细胞进行热处理 4 向上述试管中加入 1mL 预热 37 的 LB 培养液 于 37 下振荡培养 200r min 1h 5 将 50 L 100 L 上述培养液平铺于含有合适抗生素的 LB 固体培养基上 37 培养过夜 五 讨论 一 为提高转化率需考虑以下几个重要因素 1 细胞生长状态和密度 细胞生长密度不足或过高均会使转化率下降 一般 以每毫升培养液中的细胞数在 5x107个范围为好 要使用新鲜的培养液 否则效 果不佳 受体菌生长状况可用分光光度计来测定 不同菌株的合适 OD 值是不一样 的 因为 OD 值与细胞数值之间的关系随菌株的不同而异 2 转化的质粒 DNA 的浓度和质量 转化率与所加 DNA 浓度在一定范围内成正 比 但当加入的 DNA 量过多或体积过大时 则会使转化率下降 用于转化的质粒 DNA 应主要是 cccDNA 3 若在不该长出菌落的平板长出菌落 首先要考虑是否已失效 若排除了这 一因素 则说明实验有污染 如果长出的菌落相当于平板上长出的菌落而言 数量 极少 一般在 5 个以下 则此次转化还算成功 可继续以后的实验 如果长出的菌 落很多 则需设计对照实验 找出原因后 再重新进行转化 4 本实验方法使用于 E coli 各菌株 但同一菌株与不同质粒 DNA 的转化率 是不一样的 有的重组质粒转化率会很低 二 转化是 DNA 扩增和在体内进行基因研究的关键步骤 转化有多种方法 常用的有氯化钙法 氯化铷法 一步法 与其他两种方法相比一步法很容易 它无 需离心 漂洗 热处理以及特殊仪器 如电穿孔法 另外在 PEG DMSO 和 Mg2 存在 的情况下可获得较高的转化率 感受态细胞在不做任何处理的情况下在所在容液 中可保存长达 3 个月以上 三 一般认为冰冷氯化钙溶液处理可使细菌进入 感受态 而热休克则使 细菌的细胞膜张开 这样 DNA 得以进入细胞 迄今人们为提高转化率为这一技术 进行了很多改进 本实验所介绍氯化钙是一种简便 快速的方法 使用本法进行转 化 每微克超螺旋质粒 pGEM 系列 可产生 107个转化菌落 四 感受态细胞的质量可以通过测定某一特定样品的转化率来衡量 转化 率定义为每微克用于转化的 DNA 在选择平板所形成的菌落数 这里 DNA 为纯质粒 通 常是在克隆实验中的载体 转化率的变动幅度很大 可以从粗放转化程序的 105 个菌落 ug 到精细转化程序高于 108个菌落 ug 粗放转化程序只适合将完整质粒 转入新的宿主菌 而精细转化程序所精心制备的感受态细胞可用于文库的构建 约 105个菌落 ug 的转化率足以满足简单克隆实验 五 一般培养液中必须含有原平板筛选转化所用的抗生素 以维持对质粒 有无的选择 部分质粒在长期无筛选压力的生长条件下会从宿主菌体内丢失 因 为那些偶然丢失了质粒后以耗能小的方式将会淘汰那些携带质粒的细菌 扩增的 质粒可以用小量法从培养基中制备 通常在这一时刻要制备培养物的保存液 方 法是将培养物分散于含有一定的甘油溶液中冻存 甘油的作用是保护细胞免受冰 晶形成的伤害 甘油贮液 这样的贮液能使同一菌株 质粒 在必要使被接种增殖 并再次制备这样的贮存液保存 六 结果分析 实验十一 菌落实验十一 菌落 PCR 反应反应 一 实验目的一 实验目的 掌握应用 PCR 的方法大量扩增阳性克隆子的技术 二 实验原理二 实验原理 将细菌在无菌水中煮沸 5 分钟 其他同质粒和基因的 PCR 反应 三 实验仪器 材料及试剂三 实验仪器 材料及试剂 实验仪器 PCR 仪 微量移液管 0 5mlEP 管 小枪头 实验材料 上述筛选试验中获得的筛选平板上的单菌落 实验试剂 PCR 所需各种试剂 四 实验步骤四 实验步骤 1 用 200 L 的枪头活无菌牙签从平板上挑取菌落