超氧化物歧化酶的分离、纯化

实验 超氧化物歧化酶的分离 纯化 超氧化物岐化酶 Superoxide dismutase 简称 SOD 广泛存在于生物体内的含 Cu Zn Mn Fe 的金属类酶 它作为生物体内重要的自由基清除剂 可以清除体内多余 的超氧阴离子 在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用 离子 02 是人体氧代谢产物 它在体内过量积累会引起炎症 肿瘤 色斑沉淀 衰老等疾病 超氧阴离子与生物体内许 多疾病的发生和形成有关 由于 SOD 能专一消除超氧阴离子 O2 而起到保护细胞的作用 SOD 作为一种药用酶 具有广阔的应用前景 并引起了国内外医药界 生物界和食品界的 极大关注 按金属辅基成分的不同可分成 3 种类型 最常见的一种含有铜锌金属辅基 CuZn SOD 主要存在于真核细胞的细胞质中 在高等植物的叶绿体基质 类囊体内以及线粒体膜间隙 也有存在 CuZn S0D 酶蛋白的分子量约为 3 2 104 纯品呈蓝绿色 每个酶分子由 2 个亚 基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体 每个亚基 肽链 含有铜 锌原子各一个 活性中心的核心是铜 第二种含有锰离子 Mn SOD 主要存在于真核细胞的线粒体和原核 细胞中 在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在 纯品呈粉红色 由 4 条或 2 条肽链 组成 第三种是 Fe S0D 过去一直认为只存在于原核细胞中 近来发现有一些真核藻类甚 至某些高等植物中也有存在 Fe SOD 纯品呈黄色或黄褐色 由 2 条肽链组成 多数情况 下每一个二聚体中含有一个 Fe 原子 实验 一 超氧化物歧化酶的活性测定 原理 SOD 的活力测定方法很多 常见的有化学法 免疫法和等电点聚焦法 其中化学法应 用最普遍 化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和 O2 利用 SOD 分解而间接推算酶活力 在化学方法中 最常用的有黄嘌呤氧化酶法 邻苯三 酚法 化学发光法 肾上腺素法 NBT 还原法 光化学扩增法 Cyte 还原法等 其中改良 的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用 化学发光法和光化学扩增法不适用于测定 Mn SOD 但对于 Cu Zn SOD 反应极灵敏 Cyte 还原法用于 Mn SOD 活力测定结果稳定 重 复性好 但专一性和灵敏度不够理想 而且需要特殊仪器 实际应用受到限制 亚硝酸盐 形成法与 CN 抑制剂或 SDS 处理相结合 应用于 Mn SOD 测定 灵敏度比 Cyte 还原法 提高数倍 而且专一性强 重复性好 操作方便 不需要特殊仪器和设备 易于实际应用 和推广 是目前较好的测定方法之一 在一般情况下 SOD 酶活性测定只能应用间接活性测定法 本实验采用邻苯三酚自氧 化方法 邻苯三酚在碱性条件下 能迅速自氧化 释放出 O2 生成带色的中间产物 反应开 始后反应液先变成黄棕色 几分钟后转绿 几小时后又转变成黄色 这是因为生成的中间 物不断氧化的结果 这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段 中间物的积累在滞 留 30 45s 后 与时间成线性关系 一般线性时间维持在 4min 的范围内 中间物在 420nm 波长出有强烈光吸收 当有 SOD 存在时 由于它能催化 O2 与 H 结合生成 O2和 H2O2 从 而阻止了中间产物的积累 因此 通过计算即可求出 SOD 的酶活性 酶活力单位定义 在 25 恒温条件下 每毫升反应液中 每分钟抑制邻苯酚自氧化率 达 50 的酶量定义为 1 个酶活力单位 试剂和器材 1 试剂 1 pH8 2 50mmol L Tris HCl 称取 Tris 0 61g EDTA 2Na 0 037g 用双蒸水溶解至 80mL 左右 用 HCl 调节 pH 8 20 用 pH 计校正 最后定容至 100mL 2 10mmol L HCl 3 50 mmol L 邻苯三酚 称取邻苯三酚 0 063g 用 10mmol L HCl 溶液溶解 定容至 10mL 避光保存 4 SOD 样液 2 器材 1 恒温水浴槽 2 紫外分光光度计 3 试管 刻度吸管 微量注射器 方法和步骤 1 邻苯三酚自氧化速率的测定 取两支试管按下表加入 25 预热过的缓冲液 然后加入预热过的邻苯三酚 空白管用 10mmol L HCl 代替邻苯三酚 迅速摇匀 立即倾入 1cm 比色杯中 在 325nm 波长处测 定光吸收值 每隔 30s 读数一次 测定 4min 内每分钟光吸收值的变化 要求自氧化速率控 制在每分钟的光吸收值为 0 07 可增减邻苯三酚的加入量 以控制光吸收值 试剂空白管 mL 自氧化管 mL pH8 2 50mmol L Tris HCl 2 982 98 10mmol L HCl0 020 01 50 mmol L 邻苯三酚 0 01 2 SOD 样液的活性测定 样品管取代自氧化管 样品管测定时先加入预热的待测酶液 再加邻苯三酚 其余步 骤同邻苯三酚自氧化速率的测定 试剂空白管 mL 样品管 mL pH8 2 50mmol L Tris HCl 2 982 98 10mmol L HCl0 02 SOD 样液 0 01 50 mmol L 邻苯三酚 0 01 3 计算 样液体积 样液稀释倍数 反应液总体积 样液速率 酶活性 50 100 070 0 070 0 mLU 实验 二 动物血中超氧化物歧化酶的提取 原理 l969 年 McCord 和 Fridovich 第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶 自然界中 SOD 分布极广 其含量随生物体的不同而不同 即使同一种生物的不同组织或同一组织的 不同部位 其 SOD 的种类和含量也有很大差别 迄今为止人们已从细菌 真菌 原生动物 藻类 昆虫 鱼类 植物和动物等各种生物体内分离得到 SOD 为拓宽提取 SOD 的原料 筛选或基因过程开发产 SOD 量较高的菌株 目前 研究开发最多的资源还是从动物血液 动物组织中制备提纯 SOD 从动物血液材料中制备 Cu Zn SOD 纯化工艺分为三个主要步骤 1 原材料的预处 理 2 粗酶液的制备 3 离子交换柱层析精制 国内多采用 Mccord 和 Fridovich 法 其主要工艺过程为 第一步 乙醇 氯仿除去血红 蛋白 第二步 有机溶剂和硫酸铵分级沉淀 第三步 离子交换柱层析精制 试剂和器材 1 试剂 1 3 8 质量分数 柠檬酸三钠 2 0 9 质量分数 氯化钠 3 95 体积分数 乙醇 4 氯仿 5 丙酮 6 pH7 6 2 5mmol L K2HPO4 KH2PO4缓冲液 7 DEAE Sephadex A 50 2 器材 1 猪血 2 恒温水浴 3 离心机 4 布氏漏斗 抽滤瓶 5 烧杯 量筒 搅棒 6 透析袋 方法和步骤 1 从猪血中提取 SOD 1 分离血球 取新鲜猪血 加入到 3 8 柠檬酸三钠抗凝液中 新鲜猪血与抗凝液的比例为 3 1 轻轻搅拌均匀 4 000r min 离心 20min 收集红血球 2 除血红蛋白 红血球用 3 倍体积生理盐水洗涤 4 000r min 离心 20min 重复三次 然后向洗净的 红血球加入 1 1 1 倍体积去离子水 搅拌溶血 30min 再向溶血液中分别缓慢加入 0 25 倍 体积的预冷 95 乙醇和 0 15 倍体积的预冷氯仿 剧烈搅拌 15min 左右 静置 1h 然后 4 000r min 离心 20min 除去变性血红蛋白沉淀 取清液 过滤 收集滤液 记录体积 测酶 活性和蛋白浓度 3 热变性 上清液加热到 65 保温 10min 然后迅速冷却到室温 3 000r min 离心 20min 弃 去沉淀物 收集上清液 记录体积 测酶活性和蛋白浓度 4 沉淀 清液在盐冰浴中冷却 然后在 5 以下的操作温度下 加入 1 5 倍量预冷丙酮 边加 边搅拌均匀 即有白色沉淀产生 静置 2 3min 迅速抽滤 弃去滤液得肉色沉淀 沉淀 物用少量蒸馏水溶解 4 000r min 离心 20min 除去不溶物 用 pH7 6 的 2 5mmol L K2HPO4 KH2PO4缓冲液透析 即得粗 SOD 溶液 记录体积 测酶活性和蛋白浓度 结果与计算 1 计算每步操作所得酶液的酶活性 蛋白浓度和比活力 2 计算每步操作的酶活性回收率 蛋白回收率和纯化倍数 实验 三 离子交换层析纯化超氧化物歧化酶 原理 本实验利用超氧化物歧化酶的解离性质 在一定缓冲液条件下与离子交换纤维素吸附 和解吸的能力不同于溶液中杂蛋白 进而除去杂蛋白 实验中选用 DE 32 离子交换纤维素 相关原理请参见实验教材中离子交换层析一章 试剂和器材 1 试剂 1 DE 32 2 缓冲液 2 5mmol L K2HPO4 KH2PO4 pH7 6 2 缓冲液 200mmol L K2HPO4 KH2PO4 pH7 6 2 器材 1 层析柱 2 5cm 25cm 2 部分收集器 3 梯度洗脱仪 4 紫外分光光度计 5 试管 透析袋 方法和步骤 1 DEAE 纤维素的预处理 1 称取 5gDE 32 撒在盛有 75mL 0 5mol L HCl 的烧杯中 室温放置 30min 不时 轻轻搅拌 2 将糊状物移入 3 号砂芯漏斗中 用蒸馏水淋洗 如此重复 每加一次去离子水 浸泡一段时间 再进行抽滤 至洗涤液 pH 等于 4 即可 pH 试纸试 3 将糊状物移入烧杯中 加入 75mL 0 5mol L NaOH 放置 30min 不时轻轻搅拌 弃去上清液 依同法用 0 5mol L NaOH 再处理一次 4 将交换剂移入 3 号砂芯漏斗中 反复用去离子水淋洗 直至洗涤液 pH 为 8 0 可用 pH 试纸测试 5 将 DEAE 纤维素浸泡在 150mL 去离子水中 用 0 5mol L 盐酸把 pH 调至 7 6 滴定可在 pH 计上进行 须使悬液最终 pH 在 10min 内无变化 然后抽滤 6 将上述滤块置于 100 毫升量筒中 加入 75mL 缓冲液 I 慢慢搅混之后 静置 20min 用倾斜法除去上清液中细微粒子 如此重复若干次 最后上清液 pH 与缓冲液 I 几 乎一致 2 装柱 1 层析柱用洗涤液洗清洁 柱的下端联接塑料管 装上螺旋夹 关上螺旋夹 柱内 装入缓冲液 I 微开螺旋夹 让缓冲液缓慢流出 赶走死区及塑料管中的气泡 柱中保留 少量缓冲液 关闭螺旋夹 2 将基本平衡好的 DEAE 纤维素浆液 约有 1 倍体积的缓冲液 I 放在抽滤瓶中减 压除尽气泡 然后沿管壁倒人柱中 待沉降至床高约 1cm 高度时 部分旋松螺旋夹 让溶 液缓慢流出去 注意此时的流速要比正常洗脱时的流速慢 陆续加入较多的浆液 直至达 到高 10cm 以上的柱床体积 3 平衡 当全部交换剂装入柱中后 用上柱起始缓冲液进行平 衡 流速可维持在 4mL 15min 直至流出液的 pH 与上柱缓 冲液完全相同 一般要平衡 8h 以上或过夜 4 层析 用毛细吸管小心吸去交换剂上面大部分液体 打开出 口使缓冲液 恰流到表面 关闭出口 用毛细吸管小心地 沿柱壁四周缓缓加入 SOD 粗酶液 打开出口 使样品溶液 进入纤维素内 至几乎露出床面时 柱壁用少量缓冲液小 心洗涤 2 3 次 然后装入缓冲液 使液面高出创面 2 3 cm 左右 5 洗脱 1 按图将梯度洗脱器和层析柱连接好 2 在洗脱瓶 A 贮存器 和洗脱瓶 B 混合器 内各装入 100mL 缓冲液 和缓冲 液 注意两洗脱瓶 特别是液面应处于同一水平面 同时应排除连接管内气泡 3 开动电磁搅拌器开关 调节搅拌速度 以混合器内缓冲液旋转而无明显旋涡为宜 4 将两瓶和柱上下连接管道打开 开始收集洗脱流出液 控制流速在 1 5mL min 收集液测定蛋白质浓度和酶活性 5 收集合并具有 SOD 活性部分的洗脱液 透析浓缩后冷冻干燥即得纯化 SOD 淡 蓝绿色产品 结果与计算 1 画出层析图谱并标出酶活曲线和线性梯度曲线 2 计算蛋白回收率 酶活回收率 纯化倍数 3 求出酶活最高峰时洗脱液盐的浓度 实验 四 金属螯合层析分离纯化超氧化物歧化酶 原理 金属螯合层析是利用固定相偶联的配基 亚氨基二乙酸 IDA 及金属离子发生螯合作 用 该金属离子又与蛋白分子中的某些含有巯基或咪唑基的氨基酸结合 金属螯合层析主要分为 3 个阶段 第一阶段是螯合介质与二价金属离子作用生成金属 螯合介质 第二阶段是在一定的条件下金属螯合介质与被分离蛋白质分子形成金属螯合复 AB 图 梯度洗脱装置示意图 合物 第三阶段是从金属螯合介质上将被分离物质解吸下来 本实验采用亚氨基二乙酸 IDA 以二纳盐形式与环氧化的琼脂糖 6B 结合 再在偏碱性 的条件下与二价金属铜离子发生可逆性螯合 二价金属铜离子又与含有咪唑基的超氧化物 歧化酶发生可逆性的螯合吸附 金属离子在螯合介质与被分离分子之间起着桥梁作用 金 属离子的一端与螯合介质连接 另一端与被分离组分结合 这两种结合方式都是可逆的 在一定条件下洗脱被分离组分 试剂和器材 1 试剂 1 琼脂糖 2 亚氨基二乙酸 IDA 3 环氧氯丙烷 4 三羟甲基氨基甲烷 Tris 5 氢氧化钠 6 氯化钠 7 硼氢化钠 8 pH10 0 2mol LNa2CO3 NaHCO3缓冲液 9 pH7 2 20mmol L 磷酸缓冲液 2 器材 1 层析柱 2 紫外分光光度计 3 部分收集器 4 沸水浴 5 金属网筛 方法和步骤 1 IDA 琼脂糖 6B 的制备 称取琼脂糖 2g 加入蒸馏水 30