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肿瘤生物治疗 2001/4/5张叔人一 肿瘤生物治疗发展概况早期的肿瘤免疫治疗多采用非特异性免疫增强剂。如卡介苗（BCG）和小棒状杆菌（C. Parvum）菌苗。膀胱癌80年代初期，Rosenburg应用LAK过继免疫治疗晚期癌症病人取得明显疗效，再次掀起免疫治疗的高潮。（TIL CIK生物导弹）90年代，比利时Thierry Boon 首先应用T细胞克隆的方法找到了人类肿瘤抗原。SEREX法发现了一批肿瘤抗原。DC肿瘤抗原肽肿瘤基因治疗。P53 Rb针对阻止肿瘤血管生成治疗肿瘤。近几年随着分子生物学的发展，在肿瘤抗原、抗原递呈和T细胞识别等方面均有了突破性进展，对于肿瘤的免疫效应机制，以及肿瘤的免疫逃逸机理有了深入的认识。众多肿瘤免疫疗法如雨后春笋般应运而生。肿瘤免疫治疗与手术、放疗、化疗三大常规疗法有明显的互补性，在控制肿瘤的复发和转移方面展示良好前景。生物治疗：应用生物的组织、细胞、蛋白质、多糖、基因等生物制剂 治疗疾病。肿瘤的生物疗法的策略：调节强化抗肿瘤免疫、祛除免疫抑制、直接杀伤或诱导肿瘤凋亡、促肿瘤分化、阻断肿瘤营养供应、提高肿瘤被杀伤的敏感性。二 肿瘤的免疫治疗策略：去除免疫抑制、提高免疫原性、增强宿主免疫细胞的反应性 以及免疫导向。1 过继免疫治疗(adoptive immunotherapy)：LAK, TIL,CIK（1） 淋巴因子活化的杀伤细胞（Lymphokine Activated Killer）：制备：IL-2； 测定：51Cr释放法、乳酸脱氢酶（LDH）释放法National Biotherapy Study Group interleukin-2Trials: Tumor Response According to Type of Cancer Response Disease CR PR MR SD PD Total (CR+PR) % Melanoma 5 28 24 58 73 33/188 18 Lung 1 7 3 18 22 8/51 16 Breast 1 4 1 13 15 5/34 15 Renal 3 10 11 76 67 13/167 8 Colon 0 1 6 36 33 1/76 1 Other 0 12 4 47 59 12/122 10 Total 10 62 49 248 269 72/638 11 CR:complete response; PR:partial response, MR:mixed or minor response SD:stable disease: PD: progressive disease.rIL-2：半衰期短，给药方式：皮内、瘤内、腔内、淋巴管内、吸入副作用：寒战、发热、恶心、乏力、心律失常、神经异常、毛细血 管渗漏综合症（Capillary leak syndrome，CLS），肺水肿预防和处理：地塞米松、消炎痛、安定类、吸氧（2）其他非MHC限制性过继免疫治疗 粘附MNC A-LAK + 抗CD3 CD3AKLAK（MNC + IL-2） + 抗CD3 + IFN-g + IL-1 CIK + MEP（TCR-Vg9、Vd2） gdT MonoethylpospateLAK、CD3AK、CIK细胞活性及增殖数量 (李殿俊) LU/106 cells Cell num. x 106 Total LU LAK 23 8 104CD3AK 18 87 1566 CIK 26 78 2028TAK ： IL-2 + 抗CD3 + Tu-Ag （2） 肿瘤浸润性淋巴细胞 富含肿瘤细胞 1.055 - 富含TIL 1.077 -（Tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）制备：肿瘤组织消化（透明脂酸酶、胶原酶、DNA酶）单细胞密度梯度分离富含TIL+IL-2/抗CD3/100Gy自体肿瘤标志：CD3+/CD8+CD3+/CD4+NK、LAK、TIL 之间的区别 NK LAK TIL来源 外周血，脾 外周血，脾 肿瘤区域抗原致敏 - - +产生条件 自然存在 IL-2 IL-2、Ag、抗CD3选择性杀瘤能力 + + +抗瘤谱 窄 广 窄MHC限制 - - +体内增殖能力 差 弱 强聚集肿瘤部位 差 差 强免疫记忆 - - +LGL 特征 + + -CD3 - -/+ +TIL和LAK体内抗肿瘤效力的比较回输TIL或LAK 早期荷瘤小鼠肺转移抑制率%数量X106 TIL+IL-2 LAK+IL-20.40.5 16812 7412 45 964810 10030 12160 284100 5926200 972肿瘤照射灭活裂解+DC注入淋巴结区域 腹股沟取淋巴结CTL克隆扩增回输2 肿瘤疫苗：(1) 细胞瘤苗a.细菌或病毒佐剂瘤苗：BCG NDV b.转基因细胞瘤苗：细胞因子(IL-2 GM-CSF) MHC (class I II B7) 共刺激分子 (B7) c. 基于DC的瘤苗：负载多肽导入肿瘤抗原基因d.红细胞瘤苗：RBC-唾液酸酶e.细胞融合瘤苗：肿瘤细胞B细胞DC(2)亚细胞瘤苗：exosome（外泌小体）近期发现DC分泌的exosome属于亚细胞结构，具有多种抗原递呈分子和T细胞共刺激分子。肿瘤抗原肽刺激的DC产生的exosome能够呈递肿瘤抗原，活化CTL，抑制和根除已建立的小鼠肿瘤，所以exosome瘤苗极具发展潜力。(3)多肽分子瘤苗：肿瘤提取抗原多肽（酸洗脱），病毒成分（HPV16-E6、E7）合成肿瘤抗原多肽，HSP(4)多糖瘤苗：MUC-1(5)基因瘤苗：CEA-痘苗V、HPV、erbB2/neu3 基于抗体的免疫治疗： Ag 抗体 抗抗体（1） 激活效应细胞（抗CD3AbCIK，TIL，抗4-1BBT）（2） idiotype-抗抗体 瘤苗（3） 抗肿瘤相关抗原抗体，体内应用直接产生抗瘤作用。Trustuzumab (Herceptin) anti-HER2 VL linker VH VL VH VLN VHC PP VHN VLC Base-loop L H H L K G G K 鼠Fab 人Fc (4)抗体导向治疗对抗体改造 克服HAMA反应 a.小分子抗体： Single chain Fv (ScFv) 1/6 Disulfide-stabilized Fv(DsFv) Permutated Fv (pFv) b.双功能抗体（Bispecific Ab） l 杂化杂交瘤技术轻重链无改变 X 2 重链不变 X 4 重、轻链均变 X 4l 化学交联 Fabl 基因重组 两套重轻链基因 c.嵌合抗体 (chimeric Ab) Fc d.人源化抗体 （humannized Ab） 重构抗体, VH,VL区6个CDR移植, 骨架区的一些氨基酸同时移植 e.人源抗体：利用基因工程技术构建的小鼠XenoMouse，产生抗EGFr单抗，在裸鼠模型显示很强的抑瘤作用。 FcR ScFv Ag T cell Tumor FcR ScFv f.T-body :T细胞表达的嵌合受体（Fv或ScFv为胞外区与Fcreceptor和链铰链区重组）。不受MHC限制，杀伤肿瘤或半抗原修饰的肿瘤。毒素分类： 双链毒素：Abrin,Ricin,Modeccin, 植物毒素 Viscumin 单链毒素：PAP,SAP,Lonin,Monoridin,内化毒素 Triuchosanthin 细菌毒素：Diptheria toxin(DT),Pseudomonas exotoxin(PE), 膜活性毒素：staphylococcal a-hemolysin(aHL),streptolysin O, E.coli a-hemolysin, pneumolysin, aerolysin, perferins, eqinatoxinsa.毒素改造：l PE664E(将结合细胞能力的DIa中Lys57,His246,Arg247, 和His249诱变为Glu,使其失去结合能力）l PE40(缺失DIa，剩40KD)l PE38(从PE40的DIb中去除365-380aa)l PE38KDEL(将PE38中DIII的C端Arg-Glu-Asp-Leu-Lys用 Lys-Asp-Glu-Leu,KDEL替代，提高IT跨膜效率） Reiter证明：ScFv-PE38KDEL较ScFv-PE38对直肠癌多 种细胞系细胞毒活性高3-5倍，体内高2倍。b.杂合毒素：植物与细菌毒素杂交 100-1000倍c.基因重组毒素：融合蛋白，必须存在与天然毒素一样的蛋白水解 位点，使毒素与载体内化时解离，便于进入胞质，发挥 杀伤效应。d.膜活性毒素：不需内化，杀伤力大，毒副作用大，需改造。 靶向治疗肿瘤相关的靶抗原 抗体靶向治疗的临床研究l 淋巴瘤Kaminski: 1996 131I-抗CD20 鼠源， 顽固性非何杰金氏淋巴瘤75% 患者有效，分化低的分化高的，化疗不敏感的也取 得较好疗效。 Knox:90Y(钇)-抗CD20对非何杰金氏淋巴瘤有效率72%（治愈率 33%）。90Y-抗个体基因型治疗B细胞淋巴瘤有效率近33% 白血病人源化抗CD33单抗M195治疗急性髓样白血病和急性早幼粒细胞白血病。131I-M195与白消安或环磷酰胺合用于骨髓移植(BMT),除去排异反应的T细胞。131I抗CD54（ICAM-1）急性髓样白血病或急性单核细胞增多型白血病的BMT，与传统全身辐射除去T细胞对正常细胞毒性小。l 结直肠癌鼠源抗表皮粘附分子单抗17-1A，对DukeC期结肠癌死亡率和复发率分别降低了30%和27%，主要与低分化肿瘤结合，ADCC，80%产生HAMA，但未影响疗效。人源化改造。放免治疗： 131I-抗A33，与骨髓也有相当数量的结合，5/23有一定的疗效。125I 与靶向抗体偶联物易为肿瘤细胞内吞。125I-抗A33，21例患者，10例显效，而骨髓细胞很少与125I标记抗体作用，被射线损伤机会少。近来证明：放射偶联物离细胞核越近，细胞毒越强，并成指数增加。免疫毒素：LeY-Ab与PE化学偶联，I期研究，5/38例好转，正常组织表达同样靶抗原，但未受损。但是，由于毒素的免疫原性强，再次使用应有效果。l 乳腺癌l 肾癌131I标记鼠源G250，由于HAMA反应，二次使用则失效。131I-G250人鼠嵌合型， 肿瘤富集浓度 0.1% （每克组织达到的注射计量，一般水平为0.001%-0.01%）, 16例中的2例有轻微HACA反应。ADCC 干扰素治疗肿瘤 肿瘤 疗效毛细胞白血病 60-90%缓解慢性白血病 50%PR淋巴瘤 37%PR+CRKaposi氏肉瘤 26%PR急性白血病 24%PR多发性骨髓瘤 20% PR+CR神经胶质瘤 17% PR+CR肾细胞癌 16% PR+CR黑色素瘤 10% PR+CR 局部应用好卵巢癌 10%PR乳腺癌 10%PR4细胞因子治疗（1） 干扰素（interferon,IFN）I型干扰素:细菌、病毒白细胞、成纤维细胞等，IFN-a 166-172aa(a1、a2亚族) 无糖基；IFN-b 166aa糖蛋白；广谱抗病毒作用，促进多数细胞MHC I类分子的表 达，提高巨噬细胞、NK细胞、CTL抗肿瘤作用。II型干扰素:IFN-g 成熟分子143aa的糖蛋白，同源双体形式存在，活化T细胞和NK细胞产生。它可上调多种细胞MHC I类分子、II类分子表达，上调血管内皮细胞细胞间粘附分子-1的表达。促转移？（2） Interleukin, IL 白细胞介素 糖蛋白18种 IL 主要生物学活性1 促T细胞分化，增殖、CTL, NK活性2促T细胞分化，增殖、CTL, NK, LAK活性3多能干细胞、T细胞增殖4促B细胞增殖，产生Ig, DC5 促B细胞分化6促T、B、干细胞增殖，Ig, 巨核细胞分化7促T、B细胞增殖，诱导LAK8趋化中性、嗜碱性粒细胞、T细胞9T细胞生长，协同IL-3刺激肥大细胞10抑制TH1，促胸腺和肥大细胞增殖11促Ig分泌，促血小板形成12协同IL-2促进CTL、NK、LAK分化13 促B细胞增殖14促B细胞增殖15CTL, NK, LAK活性16促进CD4+细胞增殖，抑制病毒复制（HIV）17促IL-6、IL-8、PGE2、MCP-1、G-CSF18NK、T IL-12：l 35KD、40KD异二聚体，激发NK、LAK、T细胞增值、分化；向肿瘤趋化；诱导IFN-g产生；促巨噬细胞产生NO；抑制肿瘤血管生成；有利于 TH1细胞分化。l 临床研究：I期 美国遗传研究所主持安全性和耐受性 II期 另一研究组， 肾癌17人中15人出现严重副作用。胃肠 道出血，肝毒性和贫血，2人死亡。 动物实验表明：第一次单计量注射两周后再多次给药可预防毒 性反应。SC代替iv ，减少用药次数，未出现毒性反应。l 改进：IL-12基因自体纤维母细胞扩增注入体内（或与灭活的瘤细胞混合，作为瘤苗）CD4+,CD8+细胞浸润，出现大量并指状细胞。对晚期肿瘤有效。（3） 肿瘤坏死因子TNF：分为两种，TNF -a又称为恶质素；TNF-b又称为淋巴毒素。两者都是同源三聚体。炎症因子，与败血症休克、发热、多器官衰竭、恶病质有关。体内外均能杀死某些类型的瘤细胞，或抑制其增殖，激活免疫细胞攻击肿瘤，增强IL-2依赖的胸腺细胞、T细胞增殖能力，促进IL-2、CSF、IFN-g等淋巴因子产生，干扰肿瘤血液供应。它的许多功能与IL-1相同。另一方面，肿瘤坏死因子又可促肿瘤有丝分裂、肿瘤扩散、血管生成和恶液质。毒性大，基因重组突变型（4） 血细胞生成因子G-CSF、GM-CSF、TPO、EPO、IL-6、SCF其他生物反应调节剂： BCG、OK432、香菇多糖、中草药（黄芪、女贞子对抗免疫抑制：PGE2-InM；Ts-CYC或低剂量辐射；反义RNA（TGF-b，IGF，IL-10）配体导向治疗： IL-2/IL-2R、EGF/EGFR三、 抗血管生成 肿瘤长至1-2mm3无新血管行成供应营养，则不能生长。策略 Four strategies (to design anti-angiogenesis agents)(1) Block the ability of the endothelial cells to break down the surrounding matrix. (2)Inhibit normal endothelial cells directly. (3)Block factors that stimulate angiogenesis. (4)Block the action of integrin, a molecule on the endothelial cell surface.1 阻断内皮细胞降解周围基质的能力2 直接抑制正常内皮细胞3 阻断刺激血管生成的因子4 阻断整合素的作用（内皮细胞表面的分子）活化内皮细胞生长、运动的因子active endothelial cell growth and movement1 vascular endothelial growth factor (VEGF)2 fibroblast growth factor (FGF)3 angiogenin4 epidermal growth factor (EGF)5 scatter factor (SF)6 placental growth factor (PlGF)7 interleukin-8 (IL-8)8 tumor necrosis factor alpha (TNF-)天然抗血管因子naturally occurring inhibitors of angiogenesis1.Angiostatin 2.endostatin3.Interferons (IFN)4.platelet factor 4 (PF4)5.thrombospondin(凝血栓蛋白)6.transforming growth factor beta(TGF-b)7.16Kd fragment of prolactin8.tissue inhibitor of metalloproteinase-1, -2, and -3 (TIMP-1, TIMP-2 and TIMP-3) l Angiostatin血管抑素：1994年OReily研究转移癌抑制机制时从Lewis肺癌鼠血清和尿中提取38Kda蛋白，亲肝素和赖氨酸，抑制血管内皮生长和新的血管形成。是纤溶酶原的酶解产物。l endostandin内皮抑素：1997年从血管内皮细胞培养上清中发现，20kDa，胶原XVIII的酶解产物，原核表达无天然折叠，可溶性差，体外无活性。皮内注射出现活性。l 抗肿瘤作用：手术、放疗、化疗、免疫治疗各有其局限性，肿瘤生长严格依赖血管形成。肿瘤长至1-2mm3无新血管行成供应营养，则不能生长。通过抑制血管形成对各种实体瘤均有效。血管内皮细胞为新生血管前体，很少发生变异，治疗效果稳定不易产生耐药性。对正常静止的血管内皮细胞无抑制作用。OReily称其为休眠疗法（dormancy therapy）。真核表达的血管抑制素有种属差异。小鼠实验中达同样抗肿瘤效果，人血管抑制素用量100mg/kg.d,小鼠血管抑制素为6mg/kg.dl 基因重组内皮抑素皮下注射已长至小鼠体重3%的多种肿瘤都缩小至镜下可见水平。凋亡率是对照组的7倍之多。接种 3% endostandin endostandin 2-6个周期l andostandin + Angiostatin 肿瘤不复发l 非实体瘤白血病血管形成在骨髓，血管形成抑制剂同样有效。l 优越性；几乎对所有的原发和转移瘤都有效。不产生耐药性。无毒副作用。给药途径方便（SC）l 问题：长期应用对人类能否产生副作用。对自发性人类肿瘤的疗效是否与小鼠实验效果相同。四 基因治疗1 策略: 基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活内容：直接攻击肿瘤（诱导凋亡和直接杀伤）、调节免疫系统、 对抗肿瘤血管生成、修饰保护正常细胞2 载体：retrovirus(RV)、adenovirus(AdV)、adenoasociated virus(AAV)、herpes simpex virus(HSV)、Epstein-Barr virus(EBV)、vaccinia virus(VV)、其他真核表达质粒 各种病毒载体的特点 RV AdV AAV HSV类型 双链RNA 双链DNA 单链DNA 双链DNA整合与细胞染色体 随机整合 不整合 定点19号短臂 可整合产生感染病毒条件缺陷病毒穿梭载体复制：辅助缺陷病毒包装细胞缺陷病毒病毒AdV, VV包装细胞PA317(gag 包装细胞 HSV或(早期病毒Pol, env) 293(E1) UV, -射线基因IE3)外源基因装载容量 8kb 35kb 4.9kb 30kb感染细胞谱 广谱，分裂期 广谱 广谱,辅助病毒 神经和上皮类细胞制备效价(PFU/ml) 106-107 1012 1012 1011-1012感染效率 较低 高 高 高安全性 有风险 安全* 安全 有风险3 基因导入方法：病毒感染、脂质体（图）、电穿孔、基因枪（图）、 裸基因注射、基因缝线等基因缝线:汤健 缝线直接涂抹DNA或通过polylysine偶联到缝线上 血管、骨骼肌、心肌比单纯注射表达率高5-10倍。尿激 酶基因缝线微小动脉缝合防止吻合口血栓形成和狭窄。基因针：用polylysine将基因粘附在不锈钢针上（75-100mg DNA） 刺入肌肉（0.2V,1mA,直流脉冲，DNA为负极无关电极为 正)电针30分钟第3天表达14天达高峰持续一个 月。针刺捻转为电针效率的1/3-1/5。基因球囊和支架：外源基因（反义N-ras）在冠状动脉中表达，抑制损伤造成的血管内膜下增生和狭窄血管外基因转移： a 外科切开蘸有基因的滤纸贴于血管外膜b 可溶性纤维蛋白DNA血管周围注射凝血酶组织凝血因子网状不溶性纤维蛋白DNA复合物天纤溶酶作用降解4 肿瘤基因治疗的靶向性和组织特异性表达（1）病毒：l RV： IL-2替代其env N端部分 IL-2-Env淋巴细胞胶联 EGF、Ab 有待评价l AdV：Ad5-纤维蛋白的糖基，经化学修饰与一种血清类粘蛋白（ASOR）和多聚赖氨酸连接物共价连接与ASOR+细胞结合l HSV：具有嗜神经性，改造成只感染分裂相胶质瘤细胞，而脑内正常细胞不受影响。l EBV：EBNA-1是EBV复制所需唯一的反式激活因子。存在于所有的EBV转化的细胞中。pFR-tk-Zta质粒中溶细胞性复制周期反式蛋白Zta是依赖EBV激活。（HBV-嗜肝性）（2）脂质体：特异性配基（抗体、凝集素、病毒表面的糖蛋白） EGF p-Lys DNA + + + - - - （3）受体介导： 转铁蛋白-多聚赖氨酸/DNAK562 EGF-多聚赖氨酸/DNAK562（5） 肿瘤组织特异性表达： 组织特异性启动子、增强子、反式作用因子调控表达。 AFP启动子/增强子-TK5 目的基因及其应用（1） 抗癌基因：P53(50%人类肿瘤伴P53基因突变)，、RB、WT-1MD安德森癌症研究中心，直接瘤内注射P53-rAdV (106-1011PFU/3次/w x2/月 x7个月), 安全和效果，以及3天前注射顺铂80mg/m2。虽然每例患者均出现抗AdV抗体，但不影响转染效率和治疗效果。 33例复发性头颈癌，2 PR，1 CR。Wild type P53产物也可用作肿瘤疫苗。（2） 免疫细胞因子基因：IFN、IL、GM-CSF、TNF（3） 抗血管生成因子； angiostatin、endostatin（4） 转化预施药物的酶类：virus-directed enzyme prodrug therapy 无毒 胞嘧啶脱氨酶(CD) 有毒5-氟胞嘧啶（5-FC） 5-氟尿嘧啶(5-FU) AFP调控-胸腺嘧啶核苷激酶（TK） 6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖（araM） 腺嘌呤阿拉伯糖苷三磷酸（araATP）（5） 膜抗原：MHC、B7、异种MHC class I 同种MHC class I Allovectin（HLA-B7/b2m，质粒DNA阳离子脂质体）瘤内注 射，9例放化疗无效的头颈鳞癌，4例PR，1例活17个月。6 反义核酸： 作用机制：与靶基因正义RNA形成复合物而被核酶剪切降解； 结合到靶基因的mRNA与5非编码区，抑制RNA与40S核糖体 亚单位的结合；结合到靶基因前mRNA上，影响前mRNA的有效 拼接；结合到已经拼接的mRNA上，影响其从胞核转运到胞浆； 影响细胞内RNA产生和降解的一系列程序；针对靶基因5 非编码区调控序列（启动子、转录因子）阻止靶基因转录。l 癌基因作靶基因： c-myc,细胞分裂进入S期所必需的。肿瘤厂伴有表达失控。 22号染色体bcr与9号染色体c-abl交互易位bcr-abl致癌 （慢性粒细胞白血病的治疗和骨髓净化） Bcl-2，肿瘤过渡表达Bcl-2抑制正常的凋亡途径。 Ha-ras,膀胱癌Ha-ras第12号密码子突变（GT），针对突变 其他：从c-jun、c-myb、N-ras、c-fos、c-sis、c-erbB2、l 生长因子及其受体基因作靶基因：肿瘤长生某些生长因子及其受体高表达，（自分泌和旁分泌）促进肿瘤生长IGF-1R，其反义核酸抑制肿瘤增殖比抗IGF-1R抗体有效bFGF，神经胶质瘤高表达TGF-a/EGF-R，促细胞转化，增殖VEGFl 细胞信号传导系统相关物质的基因PKA/Ria，肿瘤高表达（结肠癌、成神经细胞瘤、乳癌、胃癌）l 细胞周期调控物质的基因细胞周期蛋白cyclin D1-细胞增殖“油门”、“加速器”：其反义核酸抑制细胞G1向S期转换，从而抑制肿瘤生长，恶性表型逆转。l 酶类基因作靶点参与DNA合成与复制的酶：胸苷酸激酶、胸苷酸合成酶、核糖核酸还原酶、二氢叶酸还原酶；DNA聚合酶、增殖细胞核抗原（PCNA）、DNA拓扑异构酶II-a亚基。许多化疗药物以此为靶点。l 其他：多药耐药基因mdr1、CD44（粘附分子，肿瘤转移）l 理想反义核酸治疗靶基因的条件：a 肿瘤发生发展中起关键作用，而不是部分作用。b 只在肿瘤表达，正常组织不表达。（近期，端粒酶，除生殖腺细胞以外，正常组织均为阴性。）7 基因治疗的问题和发展方向：（1） 构建更为安全的病毒载体 （2）肿瘤特异性导向 （3） 肿瘤特异性表达 （4）高效载体系统（5）载体的可控性 （6）多基因转导协同效应（7）新的目的基因 （8）与其他治疗手段有机结合五、增殖病毒治疗肿瘤 1根据病毒在肿瘤内特异性增殖机制分三大类： 选择进入细胞: 有些病毒具有组织亲和性改变结合蛋白与特 定肿瘤组织结合。尚无重大进展。 选择性转录病毒增殖必须基因：肿瘤特异性启动子或增强子插入病毒增殖必须基因的上游。Johns Hopkins大学 治疗前列腺癌I期 PG-P （前列腺素特异性启动子） AdV P E1A P PG-P E1A另：人腺血管舒缓启动子控制E1B，该病毒杀伤前列腺癌细胞比杀伤正常细胞高10000倍。二军大EB病毒潜伏感染细胞特异性激活的增强子和启动子控制AdV的E1A、E1B杀伤EBV感染的细胞和瘤细胞。（鼻咽癌、淋巴瘤、胃癌） 将病毒在正常细胞中复制所必须,而在肿瘤细胞中非必须的病毒基因选择性缺失AdV 正常细胞激活P53APOAdV复制终止 E1B55kd (-) AdV增殖复制细胞溶解再感染 AdV 肿瘤: P53突变或缺失AdV 缺失E1B55kd 正常细胞激活P53APOAdV复制终止 肿瘤细胞AdV增殖复制细胞溶解再感染消灭肿瘤美国ONYX生化制药公司:缺失E1B55kd的AdV 命名为ONYX-015。对5株正常细胞无明显杀伤。最近数个研究小组的结果认为：ONYX-015作用机制与P53突变无关。I期临床:5例复发新头颈鳞癌（1次/4w）瘤内注射，3例PR； 9例（1次/日，x5, 4x109-5x1010PFU）5例多疗程， 6例肿瘤坏死（30-90%）3例PR，3例MRII期临床:常规治疗无效的头颈部肿瘤 ONYX-015 + 化疗PR 63%, CR 27% 明显优于单纯化疗组(1999.9.开始III期)Georgetown大学将HSV复制必须的基因核糖核酸还原酶活T脱氧核糖核苷酶（MSV-TK）失活，只能在含有上述酶丰富的、分裂迅速的细胞内增殖，在正常CNS细胞不能增殖（治疗神经胶质瘤）。为安全剔除的致脑炎病毒基因，称G207,几乎对所有实体瘤有效。2其他几种特异性杀伤肿瘤病毒l 呼吸道肠道过滤性病毒（reovirus）感染后早期病毒基因转录激活双链RNA激活蛋白激酶（PKR）抑制病毒其他基因转录抑制病毒有效复制。 癌Ras激活抑制PKR病毒有效复制杀瘤加拿大Calgary大学用该病毒治疗Ras高表达人胶质瘤SCID小鼠模型，65%-80% 肿瘤明显缩小或消退。对乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌同样有效。将进入临床。l NDV，自主小病毒3增殖病毒关注的几个研究方向 增殖病毒携带目的基因：IL-2、HSV-tk、CD（胞嘧啶脱氨酶）， 增强抗肿瘤作用。 减少病毒的免疫原性：更换不同血清型的AdV；IL-12、IFN-g抑 制中和抗体产生。 寻找肿瘤特异性增强子、启动子，控制病毒增殖必须基因，产生 新型肿瘤特异性增殖病毒。4 选择增殖病毒时，病毒应有以下特征： 必须能在肿瘤内选择性增殖，并溶解瘤细胞； 病毒所导致的人类疾病必须是轻微的，已熟知的。如有致病性 需有有效抗病毒治疗方法； 该病毒增殖和治病的基因均已清楚； 具有遗传稳定性极少能恢复为野生型病毒； 不整合到人的基因组； 容易产生高滴度的病毒，易于生产纯化； 体内能感染多种组织及细胞； 有理想的动物模型进行临床前毒性研究。六抗端粒酶治疗肿瘤1 端粒、端粒酶与肿瘤的关系（1）端粒和端粒酶l 三四十年代，染色体末端存在一种维持染色体稳定和完整的特殊结构端粒（telomere）,它能防止染色体DNA降解、末端融合、缺失和非正常重组。l 八十年代，端粒结构：端粒DNA-端粒结构蛋白。人和脊椎动物端粒DNA均为（TTAGGG）nDNA 5 3 3 RNA 5 端粒DNA l 1985年，四膜虫中发现端粒酶（telomerase）。1998年，耶鲁大学Morin从人宫颈癌细胞中发现人端粒酶。端粒酶：是一种核糖核蛋白，由蛋白质和与端立互补的RNA组成，它能以自身RNA为膜板合成端粒DNA，本质上属你转录酶。 端粒酶 RNA 蛋白质 端粒 DNA尖毛虫属（2） 肿瘤的“端粒-端粒酶”假说 1991年，Harley提出“端粒-端粒酶”假说。他认为：端粒可能是细胞有丝分裂的计时钟（mitotic clock）。细胞在有丝分裂中，端粒DNA不断丢失，使端粒缩短。缩短到一定程度时可能触发某种信号，退出细胞周期而老化，死亡。此阶段端粒酶被激活，恢复端粒的功能，使细胞逃避死亡而获