简单认识抗凝和纤溶系统

抗凝和纤溶系统,陈华云,上海交通大学医学院附属第三人民医院检验科,HAPPY CHILDRENS DAY,岁月把回忆印在心头, 但童心是一种心态， 即使岁月蹉跎，时光荏苒， 珍惜它，爱惜它， 你将年轻永驻!,止血、凝血,血栓,抗凝、纤溶,出血,血栓与出血的平衡,PART 1,抗 凝 系 统,细胞因素： 单核巨噬细胞系统：促凝物可被吞噬和清除 肝细胞：被激活的凝血因子可被肝脏摄取和灭活 及合成抗凝物AT、2-M 血管内皮细胞： 合成或释放PGI2抑制PLT聚集 释放表面的硫酸乙酰肝素、TM抗凝作用 合成或释放t-PA激活PLGPL促进纤溶体液因素：主要是生理性抗凝蛋白 抗凝血酶 蛋白C系统 组织因子途径抑制物,抗血液凝固系统,抗凝系统,特性：合成 主要由肝脏 血管内皮细胞和巨核细胞合成少量 性质 属球蛋白，半衰期61-72h。,作用 依赖肝素的丝氨酸蛋白酶抑制物 在肝素存在时抗凝效果增加1000倍以上 a不被AT抑制,一、抗凝血酶（antithrombin, AT）,是主要的生理性血浆抗凝物质，尤其对凝血酶的灭活能力占所有抗凝蛋白的70%-80%。,肝素+AT （构型改变暴露活性中心）精氨酸 +IIa、Xa、XIIa、XIa、IXa、K、PL (丝氨酸蛋白酶) （1：1形成复合物） 从而使这些酶失去活性 肝素重新释出继续下一个作用,AT抗凝原理,先天性AT缺乏 易导致静脉血栓形成， 与动脉血栓形成关系不大。,获得性AT缺乏见于 合成障碍：肝受损 丢失过多：肾病 消耗过度：DIC、DVT、M3等,AT缺乏所致疾病,1蛋白C（PC）：肝合成，依赖VK，糖蛋白， 不被AT灭活。 PC APCAPC的主要作用：1）灭活Fa和Fa，需要磷脂和Ca+的参与。2）抑制FXa 与血小板膜磷脂的结合。3）增强纤溶活性，刺激纤溶酶原激活物释放。,凝血酶+TM,EPCR,二、蛋白C系统,包括：PC、PS、TM、EPCR,因子V Leiden突变,“活化蛋白C抵抗”试验-APCR试验： 患者血浆+APC，不能使APTT延长 是由于FV基因（1691）位突变引起 致使对APC灭活作用不敏感。 但FV的凝血辅因子功能不受影响 APC抗凝作用降低 凝血酶生成增加,DVT,合成与PC相似，依赖VK。1977年在美国Seattle 发现的一种蛋白质，故称PS。为APC的辅因子，增强APC与磷脂的亲和力。 可使APC活性增加十倍 60%结合-结合C4结合蛋白（C4bp）两种形式存在 属于急性时相反应物 40%游离-才能作为APC的 辅因子参与抗凝机制急性炎症及相关疾病中C4bp水平增高，游离PS降低。,2、蛋白S（PS）,血管内皮细胞合成是凝血酶的受体,2万倍以上,3、凝血酶调节蛋白（TM）,凝血酶+TM 复合物 加速PC（活化）,APC,内皮细胞表面的EPCR可使 凝血酶TM复合物将PC激活的速度 提高5倍,4、内皮细胞蛋白C受体（EPCR）,由血管内皮细胞、血小板、单核细胞、肝合成。是1995年新确定的一种血浆抗凝蛋白 其在生理性抗凝蛋白作用中占相当重要的比重， 直接参与了血液凝固的过程。 TF-a 复合物的抑制物 直接抑制FXa 抗凝原理 TFPI首先结合于Xa的活性中心，形成TFPI-Xa，然后在 Ca+存在下与TF-a形成多元复合物，使其活性丧失。,三、组织因子途径抑制物（tissue factor pathway inhibitor,TFPI）,1蛋白Z（PZ）： 依赖VK的糖蛋白，肝脏合成，可被凝血酶裂解 DIC、肝病、骨纤、新生儿的PZ水平都很低 PZ Xa失活 在磷脂和Ca+的存在时变得更加明显,四、蛋白Z和蛋白Z依赖的蛋白酶抑制物,2.蛋白Z依赖的蛋白酶抑制物（PZI）： 丝氨酸蛋白酶，肝脏合成 血液凝固或血栓形成时会大量消耗 Xa-PZ-PZI复合物 灭活Xa功能增强PZ、PZI缺陷 可导致血栓形成,四、蛋白Z和蛋白Z依赖的蛋白酶抑制物,1、2 巨球蛋白（2-M） 抑制：a 、K、PL2、1抗胰蛋白酶（1-AT） 抑制：Fa 、a 、PL3、C1抑制物（C1-INH） 抑制：Fa、 F a、激肽释放酶、 PL、补体1,五其他凝血抑制物,4肝素：肥大细胞合成，酸性粘多糖主要抗凝原理： 肝素+AT 以丝氨酸为活性中心的蛋白酶 高分子肝素a，抗凝效果强，作用快， 维持时间短。低分子肝素Xa，抗凝效果较弱，作用慢， 维持时间长。,五其他凝血抑制物,灭活,PART 2,抗凝物质检测,1、抗凝血酶活性（AT：A） 检测方法：发色底物法,原理：血浆+肝素(一定量)+凝血酶(过量) AT 凝血酶 PNA 剩余的凝血酶呈正相关 (显色） AT:A呈负相关,灭活,（一）、抗凝血酶测定,一、生理性抗凝蛋白,降低:先天性缺陷，引起反复静脉血栓形成。 获得性缺乏症： 合成减少，肝病。 消耗增多，血栓前状态和血栓形成性疾病。 丢失增加，见于肾病综合征等。 判断肝素抗凝是否有效的指标： AT：A 70% 肝素效果减低 AT：A 50% 肝素效果明显减低 AT：A 1.8,激活剂(蝰蛇蛇毒)、Ca+,脑磷脂,LAC检测方法,筛选试验原理:,确诊试验原理：,LAC临床意义,红斑狼疮、干燥综合征、自身免疫性疾病。习惯性流产、不良妊娠史。反复动、静脉血栓史。恶性肿瘤（转移）。炎症、药物。,PART 3,纤维蛋白溶解系统,PA Fb(g) 指 PLG PL FDP,出血,血栓,纤溶机理也是一系列的酶促反应 分为纤溶酶原激活和纤维蛋白（原）降解两个阶段,纤维蛋白溶解系统（fibrinolyic system）,纤维蛋白溶解系统（fibrinolyic system）,一、纤溶系统的成份及功能,二、纤维蛋白溶解机制,三、纤维蛋白（原）降解产物的作用,一、 纤溶系统的成份及功能,纤溶酶原（plasminogen,PLG）组织型纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator,t-PA）尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase-like plasminogen,u-PA）纤溶酶(plasmin, PL)纤溶抑制物,参与纤溶系统的酶都归类于丝氨酸蛋白酶,肝脏合成， 半寿期约为 2.2天，血浆浓度200mg/L,（一）纤溶酶原（plasminogen,PLG）,作用机制：,血管内皮细胞合成，在肝脏被清除。功能 单链（sct-PA） 双链(tct-PA) Fb是t-PA活化PLG的最佳催化物，也是必要的辅助条件。,PL,PLG,PLG,t-PA,t-PA,PL,当：t-PA和PLG都处于游离状态时，一个t-PA活化一个PLG 需30分钟。而：两者结合到Fb上后，只需12秒即可活化PLG，相差150倍。,PL,（二）组织型纤溶酶原激活物（t-PA）,主要从尿中提取，由肾小管上皮和血管内皮细胞等产生 血中浓度2-20g/Lu-PA可直接激活PLG而不需Fb作为辅因子。 单链u-PA：未活化的尿激酶， PL、K 双链u-PA：已活化，活性比单链提高100倍。,（三）尿激酶型纤溶酶原激活物（u-PA）,PLG PL PL是一种活性较强的丝氨酸蛋白酶 作用： 1 降解Fg和Fb 2 水解多种凝血因子（FV、VIII、X、VII、XI、II） 3 使谷氨酸纤溶酶（原）转变为赖氨酸纤溶酶（原） 4 分解血浆蛋白和补体 5 可将单链t-PA、u-PA转变为双链t-PA、u-PA 6 可降解GPIb、GPIIb/IIIa 另外，PL在较高浓度时能激活血小板和内皮细胞,t-PA、u-PA,（四） 纤溶酶（plasmin，PL）,促进凝血,分为 ： 1.抑制纤溶酶原激活剂： PAI-1、PAI-2、PCI。 2抑制纤溶酶： 2-AP、2-巨球蛋白。,（五）纤溶抑制物,能特异地抑制t-PA激活PLGPAI-1：由血管内皮细胞和血小板合成 PAI-1+PL 不可逆的复合物（PAI-1+PL）。 血中纤溶活性调节主要取决于 内皮细胞分泌t-PA / PAI-1的相对比例。 血浆中PAI-1在体外不稳定，半寿期约20分钟。 （因其活性中心的蛋氨酸极易被氧化， 氧化后即不能形成复合物。）,1 纤溶酶原激活抑制物（PAI）,PAI-2：来源于胎盘和单核巨噬细胞 正常人含量极少 5g/L , 妇女妊娠期会升高. 体内PAI,主要取决于PAI-1, PAI-2 一般情况下 不参与血管内纤溶调节.,1 纤溶酶原激活抑制物（PAI）,2 -抗纤溶酶（2-AP）： 肝合成，为人体主要纤溶酶抑制物。 作用： A、抑制纤溶酶。 B、抑制FXa、XIa、和XIIa。 C、抑制胰蛋白酶。 机制：2-AP+PL（1：1）复合物，使PL活性减弱其他： AT、2 -M、1-AT也有抗纤溶酶的作用。,2 纤溶酶抑制物,二、纤维蛋白溶解机制,（一）纤溶酶原激活,（二）纤维蛋白（原）降解,1 内激活途径,2 外激活途径,3 外源激活途径,1 纤维蛋白原的降解,2 可溶性纤维蛋白的降解,3 交联性纤维蛋白的降解,1 内激活途径 PK K tcu-PA（双） PLG PL 此是继发性纤溶的理论基础,FXIIaHMWK,scu-PA（单）,（一）纤溶酶原激活,2 外激活途径 PLG PL 此是原发性纤溶的理论基础。,u-PA,t-PA,vEC,nEC,血管,肾小球,PAI1、PAI2,（一）纤溶酶原激活,3 外源激活途径 外界进入体内的溶栓药物如： SK、UK、rt-PA 此为溶栓治疗的理论基础。,SK、UK,rt-PA,（一）纤溶酶原激活,PLG,PL,1 纤维蛋白原的降解 Fg 去两端 （碎片A、B、C、H） +肽B1-42+碎片X 碎片Y+碎片D 碎片E+碎片D,PL,FgDP,(二)纤维蛋白（原）降解机制,PL,PL,2 可溶性纤维蛋白的降解（1）纤维蛋白I（Fb-I）的降解 （最终碎片X、Y、D、E）（2）纤维蛋白II（Fb-II）的降解 （最终碎片X、Y、D、E）,(二)纤维蛋白（原）降解机制,PL,肽B1-42+碎片A、B、C、H,Fb-1,Fb-II,肽B15-42+碎片A、B、C、H,PL,Fb-I +Fb-II 交联纤维蛋白 PL 碎片X、Y、D、E+D-D +复合物(DDE、DXD、DY、YY等）,FXIIIa,FbDP,FbDP,FgDP,FDPs,3 交联性纤维蛋白的降解,(二)纤维蛋白（原）降解机制,纤维蛋白(原)的降解机制,纤维蛋白原,非交联纤维蛋白,交联纤维蛋白,纤溶酶,纤溶酶,纤溶酶,凝血酶,FXIIIa,FPA、FPB,X、Y、D、E,B 1-42,A、B、C、H,X、Y、D、E,B 15-42,A、B、C、H,X、Y、D、E,D二聚体,DD-E聚合物等,FDPs,FDPs,-具有抗血液凝固的作用,（1）、碎片X（X）：与Fg、FM结构相似，可与Fg竞 争凝血酶，与FM形成复合物，阻止FM的交联。（2）、碎片Y（Y）：抑制FM的聚合及抑制FM形成不 溶性Fb。（3）、碎片D和E（E）：D抑制FM的聚合，E（E） 竞争凝血酶。（4）、极附属物A、B、C、H：可延长APTT及凝血时间。,三、纤维蛋白（原）降解产物的作用,PART 4,纤溶活性检测,t-PA：A-发色底物法原理：受检血浆+过量PLG + Fb的共价物（血浆中 t-PA吸附于Fb）使PLG PL（发色底物S-2251） 释出PNA而显色，深浅与t-PA呈正相关。临床评价：t-PA随年龄的增加而增高，采血时最好不用止血带，加压后会引起t-PA进入血液。取血后尽快在低温分离血浆。 增高：纤溶亢进，见于原纤、继纤，如DIC等。 减低：纤溶减弱，见于高凝状态， 如：深V血栓形成，高脂血症等。,(一)、血浆组织纤溶酶原激活剂活性检测,（PLG：A） -发色底物法原理：血浆PLG PL S-2251 PNA 呈正相关临床意义： 增高：纤溶减低，见于血栓前状态和血栓性疾病。 减低：纤溶亢进，见于原纤、继纤和先天性PLG缺乏症。,SK,显色,PLG测定可替代优球蛋白溶解时间测定，了解纤溶状况。,(二)、血浆纤溶酶原活性检测,PLG：Ag-酶标法（双抗体夹心）临床意义：同PLG：A。PLG缺乏症 CRM+型：PLG：Ag或PLG：A CRM-型：PLG：Ag或PLG：A均,(三)、血浆纤溶酶原抗原检测,（2-AP：A，2-PI：A） -发色底物法原理：受检血浆+过量PL复合物， 剩余PL发色底物显色， 深浅与PL呈正相关，与2-AP呈负相关。临床意义： 增高：见于V、A血栓形成、恶性肿瘤、分娩后等。 减低：见于肝病、DIC、手术后、先天性2-AP缺乏症。,(四)、血浆2纤溶酶抑制剂活性检测,ELISA参考值： 0.590.13 mg/L.临床意义： 1. PAP是纤溶酶与抗纤溶酶形成的复合物。 它反映人体纤溶系统的状态，水平升高多见于 原发性和继发性纤溶亢进。 2. 在DIC的早期，PAP可正常或轻度下降，而在 DIC的继发性纤溶期，PAP明显上升。,（五）、纤溶酶-抗纤溶酶复合物检测-PAP,（六）、纤维蛋白(原)降解产物(FDP),是反映体内纤溶活性总水平的参数,ELISA法、胶乳凝集法、免疫比浊法,增高： 见于原发性纤溶和继发性纤溶症。 如：DIC、恶性肿瘤、急性早幼粒细胞白血病、 肺栓塞、深静脉血栓形成、肾脏疾病、 肝脏疾病、器官移植的排斥反应、 溶栓治疗等。,D-D 的产生,（七）、血浆D-二聚体（D-D）测定,纤溶酶原,纤维蛋白原,纤维蛋白,FDP，D-D,纤溶酶,纤溶酶原激活物,原发性纤溶,继发性纤溶,FDP,2 -PI,纤维蛋白降解特征性产物,临床应用： DVT/PE的排除诊断较好的指标 DIC的诊断和监测 溶栓治疗的监测 预测动脉粥样硬化、心梗复发 恶性肿瘤的转移 预测术后血栓形成,检测方法：免疫比浊法、 ELISA法、胶乳凝集法,（七）、血浆D- D二聚体（D-D）测定,DIC的排除诊断效率可达80%,联合FDP达95%诊断效率远远高于PT、血小板计数、纤维蛋白原、TT等反映DIC的严重程度,（七）、血浆D-二聚体（D-D）测定,D-D二聚体在DIC诊断中的意义,用药起效,用药不足,*对D-D二聚体检测的要求：快速、定量、宽范围,（七）、血浆D-二聚体（D-D）测定,明显升高（与治疗前比较有数倍变化）出现山峰状改变说明溶栓药物达到疗效从峰值下降后可以逐渐停药升高后维持一个平台期，则提示用药不足,特点： 1、多在原发性疾病的极期出现出血症状。 2、出血往往较为严重，常见皮肤大片状淤斑, 皮下血肿，注射部位或创面出血不止。 3、继发性纤溶微循环衰竭、多脏器功能不全、 溶贫。 4、原纤对抗纤溶药物有显著疗效，继发性纤 溶只有解除病因才有效。,（八）纤溶活性亢进筛选试验的应用,FDP阴性，D-D阴性 纤溶活性正常FDP阳性，D-D阴性 原发性纤溶亢进FDP阴性，D-D阳性 FDP假阴性或D-D假阳性FDP阳性，D-D阳性 继发性纤溶亢进,（八）纤溶活性亢进筛选试验的应用,Fg FM Fb FDP,凝血酶,肽A、肽B,纤溶酶,FM-FDP,肉眼可见的纤维状、絮状或胶冻状,硫酸鱼精蛋白,-FM-FM-,可溶性,应引起注意的几点：1、假阳性：抽血不顺利、抗凝不完全、标本久置于冰箱、 到时未立即观察结果或输液导管内采血。2、加样后即刻出现浑浊或颗粒，随后又清晰。“阴性”3、阳性见于DIC早、中期，大手术后。,（九）血浆鱼精蛋白副凝固（3P）试验,原理,PART 5,抗凝和溶栓治疗的监测,抗栓治疗存在的问题,药物应用过量，造成出血并发症药物用量不足，达不到预期效果,对策实验室监测保证安全性，有效性,问题&对策,口服抗凝剂治疗,普通肝素,AT:A70%，补充APTT 对照的1.5-2.5倍ACT体外循环400-600s肝素定量检测0.2-0.5U/mlBPC 50109/L，停用肝素/单采血小板,低分子量肝素,AT:A70%，补充抗因子a活性测定（因子a抑制试验）安全、有效0.5-1.0 AXaU/mlBPC 50109/L，停用肝素/单采血小板,是否会见效指标： 2 PI1.5g/L，TT正常对照的3倍， FDPs400mg/L，出血并发症增加3倍 维持Fg在1.2-1.5g/L，TT在正常1.5-2.5倍，FDPs在300-400mg/L适宜,PART 6,血栓止血检测的质量控制,受检者的状态 标本采集 抗凝剂与检测试剂 设备和仪器 检测方法 操作者技术 血小板聚集因素,一、分析前的质量控制,剧烈运动和月经期纤溶活性增高 吸烟可使血小板聚集性增高饮酒可抑制血小板聚集性高脂食物造成血脂升高可抑制纤溶活性,1、受检者的状态,口服避孕药可增加凝血活性、降低纤溶活性 口服潘生丁、阿司匹林等抑制血小板功能肝素和口服抗凝剂等抑制凝血机制尿激酶和葡激酶等促进纤溶功能等,1、受检者的状态,确认病人的身份及容器（硅化或塑料）。多次反复采血的病人在同一条件下采血。止血带不要超过5分钟，强调采血顺利。迅速将血液和抗凝剂轻轻的颠倒混匀。,2、采血方法,3、标本的贮存,冷冻，不宜冷藏,全血1小时内分离血浆，2小时内不检测应贮存在0以下。冷冻血浆置37水浴中迅速融化。血液贮于塑料或硅化试管中，用塑料移液管分离血浆。,4、标本的运送,最好在室温下运送