煮沸法快速提取质粒

煮沸法快速提取质粒以及 DNA 酶解 和琼脂糖电泳 实验目的 实验原理 材料试剂 操作步骤 注意事项 思考题 选择实验 一 实验目的 1 掌握质粒 DNA 分离 纯化的原理 2 学习煮沸法快速提取质粒 DNA 的方法 3 学习 DNA 的限制性酶切的基本技术 4 学习利用琼脂糖电泳测定 DNA 片段的长度 二 实验原理 在基因工程中 DNA 分子的切割是由限制性内切酶来完成的 限制性内切酶能识别特定的 DNA 序列 在一定的条件下切断双链 DNA 限制性内切酶的作用效率是受多方面因素影响的 如反应温度 缓冲体系 离子种类与浓度 DNA 的纯度和甲基化程度等 对 DNA 进行酶切时 首先要选择适合的缓冲液 对于 单酶切 应选用该酶的最适缓冲液 对于双酶切或三酶切 应选用一种能使所有酶都充分作用的缓冲液 DNA 的纯度对于酶切的效果的影响也很大 因为蛋白质 酚 氯仿 SDS 等杂质都会抑制限制性内切酶 的活性 琼脂糖凝胶电泳是分离 鉴定和纯化 DNA 片段的常规方法 利用低浓度的荧光嵌入染料 溴化乙锭进行 染色 可确定 DNA 在凝胶中的位置 如有必要 还可以从凝胶中 回收 DNA 条带 用于各种克隆操作 琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低 但其分离范围较广 用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度 为 200bp 至近 50kbp 的 DNA 长度 100kb 或更大的 DNA 可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电 场凝胶电泳进行分离 在基因工程的常规操作中 琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛 它通常采用水平电泳装置 在强度和方向恒定的 电场下进行电泳 DNA 分子在凝胶缓冲液 一般为碱性 中带负电荷 在电场中由负极向正极迁移 DNA 分子迁移的速率受分子大小 构象 电场强度和方向 碱基组成 温度和嵌入染料等因素的影响 三 实验材料和试剂 1 菌种 含 pUC18 的大肠杆菌 JM107 菌株 2 化学试剂和溶液 1 LB 培养基 NaCl 10g l 酵母提取物 5g l 胰蛋白胨 10g l 氨苄青霉素 50 g ml 培养基灭菌后加入 pH7 0 2 70 乙醇 20 及无水乙醇 20 3 STET 缓冲液 pH8 0 8 蔗糖 0 5 Triton 50mmol L EDTA 10mmol L Tris 4 5 CTAB 十六烷基三甲基溴化氨 5 1 2M 氯化钠 6 TE 缓冲液 10mmol L Tris HCl 1mmol L EDTA 7 电泳缓冲液 50XTAE Tris 242g 冰醋酸 57 1ml EDTA 0 5mol LpH8 0 100ml 使用时用蒸馏水稀释 50 倍 8 样品缓冲液 6X 0 25 溴酚蓝 0 25 二甲苯青 40 W V 蔗糖 9 溴化乙锭 10mg ml 10 琼脂糖 电泳级 11 限制性内切酶 12 溶菌酶 50mg ml 溶于 10mmol L Tris HCl pH 8 0 3 仪器设备 台式离心机 超净工作台 高压灭菌锅 恒温振荡培养箱 恒温水浴箱等 Eppendorf 离心管 Tip 头 三角瓶等灭菌备用 电泳仪 电泳槽 样品梳 微波炉 水浴锅 移液器 20ul 200ul 和 1000ul 离心管 Tips 200ul 1000ul 四 操作步骤 1 质粒提取 1 将 2ml 含相应抗生素的 LB 培养基加入到容量为 15ml 的试管中 接种一单菌落 用棉塞封口 在 37 剧烈震荡 250rpm 培养过夜 2 将 1 5ml 培养物转入离心管中 用台式离心机在 4 条件下离心 30 秒 12 000 g 3 弃上清液 用滤纸吸干离心管中的液体培养基 将细菌沉淀物悬浮于 200 m l STET 缓冲液 用涡旋 混合器充分混匀 4 加入 4 m l 新鲜配制的溶菌酶液 混匀 置室温下 5min 5 用漂子架住离心管 置于沸水浴中 精确记时 45 秒 取出后立刻离心 10min 6 用无菌牙签挑取离心管中的沉淀物弃去 离心管的上清液中加入 8 m l 5 CTAB 用混合器混匀后 高速离心 5min 弃上清液 用滤纸吸干离心管中的液体 7 加入 1 2M 氯化钠 300 m l 充分溶解沉淀物 再加入 750 m l 的冷乙醇 充分混匀后 离心 15min 弃上清液 8 取 1ml 70 冷乙醇 缓慢淋洗离心管内壁 离心 5min 弃上清液 用滤纸吸干管壁上的液体 置 室温中使核酸沉淀自然干燥 5 10min 9 沉淀物溶于 50 m l TE 缓冲液中 混合器混匀 9 即成质粒制备液 制备的质粒供下一步实验使用 2 DNA 的酶解 设置 DNA 的酶切反应 按下列顺序加样 体积 m l 反应管 对照管 置备的质粒 DNA 2 2 酶反应液 10 2 2 双蒸水 15 16 限制性内切酶 5U 1 0 总体积 20 20 加完反应液 混匀 离心 1 分钟 置于 37 0 C 水浴中 反应 2 小时 加入加样缓冲液 10 2 m l 3 质粒 DNA 的琼脂糖电泳 1 量取 100 毫升 TAE 电泳液 加入 0 7 克琼脂糖 混匀后 置于微波炉中 加热 3 分钟 充分溶解琼脂糖 注意观察 当心煮沸的液体 溢出 注意观察 当心煮沸的液体 溢出 2 用灭菌后的橡皮胶 封闭清洁干燥的电泳板 并用少量的琼脂糖液封边 安放梳子 调整梳子的底部边 缘与电泳板之间的距离 一般以 1 2 毫米为宜 3 当溶解后的琼脂糖液冷却至 50 0 C 左右时 加入溴化乙锭 5 m l 溴化乙锭的最终浓度为 1 0 m g ml 混 匀后 将琼脂糖液倒入电泳板中 静止 切勿移动 4 在凝胶完全凝固后 于室温放置 30 45 分钟 轻轻地取出梳子 除去胶带 将凝胶放入电泳漕中 5 电泳漕中 加入电泳液 1 TAE 使电泳液覆盖在琼脂糖胶面之上约 1 2 毫米 6 取上一实验制备的质粒提取液 酶切 加入 1 5 样品缓冲液 充分混匀 用移液器将样品小心地加入 点样孔 在不同的点样孔中 分别加入 DNA 分子量标记物 marker 对照以及质粒提取液 酶切 样 品 7 接通电源 在 90V 下 电泳 1 小时 当溴酚兰颜料迁移至凝胶前沿时 切断电源 8 取出凝胶 在紫外灯下 观察 DNA 的迁移位置 并讨论实验结果 五 注意事项 1 从细菌沉淀中或核酸沉淀中去除上清液时 一定要彻底 不能留有残余 2 用 70 的乙醇溶液洗涤核酸沉淀时一定要十分小心 防止将核酸同洗液一起去掉 3 在实验过程中所用的器皿和吸头等都要进行高压灭菌 4 酶切时 应尽量减少反应中的加水量以使反应体系减到最小 但要确保酶体积不超过反应总体积的十分 之一 否则限制酶活性将受到甘油的抑制 5 进行酶切消化时 将除酶以外的所有反应成分加入后再从冰箱中取出酶 并应放置于冰上 每次取酶时都 应换一个无菌吸头 操作要尽可能快 用完后立即将酶放回冰箱操作要尽可能快 用完后立即将酶放回冰箱