克隆载体与表达载体

克隆载体 克隆载体 大多是高拷贝的载体 一般是原核细菌 将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接 再大多是高拷贝的载体 一般是原核细菌 将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接 再 导入原核细菌内 质粒会在原核细菌内大量复制 形成大量的基因克隆 被克隆的基因不一定会表达 但导入原核细菌内 质粒会在原核细菌内大量复制 形成大量的基因克隆 被克隆的基因不一定会表达 但 一定被大量复制 克隆载体只是为了保存基因片段 这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作 一定被大量复制 克隆载体只是为了保存基因片段 这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作 克隆载体克隆载体 Cloning vector 携带插入外源片段的质粒或噬菌体 从而产生更多物质或蛋白质产物 携带插入外源片段的质粒或噬菌体 从而产生更多物质或蛋白质产物 这是为这是为 携带携带 感兴趣的外源感兴趣的外源 DNA 实现外源 实现外源 DNA 的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些 DNA 分子 分子 其中 为使插入的外源其中 为使插入的外源 DNA 序列可转录 进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体 序列可转录 进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体 是否含有表达系统元件 即启动子是否含有表达系统元件 即启动子 核糖体结合位点核糖体结合位点 克隆位点克隆位点 转录终止信号 这是用来区别克隆载体和转录终止信号 这是用来区别克隆载体和 表达载体的标志 表达载体的标志 表达载体 有的是高拷贝的 有的是低拷贝的 各有各的用处 是一些用于工程生产的细菌 被导入的目表达载体 有的是高拷贝的 有的是低拷贝的 各有各的用处 是一些用于工程生产的细菌 被导入的目 标基因会在此类细菌中得到表达 生产出我们需要的产物 导入的基因是由克隆载体产出的 表达载体具标基因会在此类细菌中得到表达 生产出我们需要的产物 导入的基因是由克隆载体产出的 表达载体具 有较高的蛋白质表达效率 一般因为具有强的启动子 有较高的蛋白质表达效率 一般因为具有强的启动子 表达载体 表达载体 Expression vectors 就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件 如启动子 就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件 如启动子 RBS 终止子等 是目的基因能够表达的载体 如表达载体 终止子等 是目的基因能够表达的载体 如表达载体 pKK223 3 是一个具有典型表达结构的大是一个具有典型表达结构的大 肠杆菌表达载体 其基本骨架为来自肠杆菌表达载体 其基本骨架为来自 pBR322 和和 pUC 的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因 在表达元的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因 在表达元 件中 有一个杂合件中 有一个杂合 tac 强启动子和终止子 在启动子下游有强启动子和终止子 在启动子下游有 RBS 位点 如果利用这个位点 要求与位点 如果利用这个位点 要求与 ATG 之间间隔之间间隔 5 13bp 其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因 其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因 RBSRBS 位点 位点 19741974 年年 ShineShine 和和 DalgarnoDalgarno 首先发现 原核生物 在首先发现 原核生物 在 mRNAmRNA 上有核糖体的结合位点 它们上有核糖体的结合位点 它们 是起始密码子是起始密码子 AUGAUG 和一段位于和一段位于 AUGAUG 上游上游 3 3 1010 bpbp 处的由处的由 3 3 9bp9bp 组成的序列 这段序列富含嘌呤核苷组成的序列 这段序列富含嘌呤核苷 酸 刚好与酸 刚好与 16S16S rRNArRNA 3 3 末端的富含嘧啶的序列互补 是核糖体 末端的富含嘧啶的序列互补 是核糖体 RNARNA 的识别与结合位点 根据发现者的的识别与结合位点 根据发现者的 名字 命名为名字 命名为 Shine DalgarnoShine Dalgarno 序列 简称序列 简称 S DS D 序列 序列 由于它正好与由于它正好与 30S30S 小亚基中的小亚基中的 16s16s rRNA3 rRNA3 端一部分序列互补 因此端一部分序列互补 因此 S DS D 序列也叫做核糖体结合序列 序列也叫做核糖体结合序列 真核生物真核生物存存在在于于真真核核生生物物 m mR RN NA A 的的一一段段序序列列 其其在在翻翻译译的的起起始始中中有有重重要要作作用用 加加K Ko oz za ar rk k s se eq qu ue en nc ce e G GC CC CA AC CC C K Ko oz za ak k s se eq qu ue en nc ce e 是是用用来来增增强强真真核核基基因因的的翻翻译译效效率率的的 是是最最优优化化的的A AT TG G 环环境境 避避免免 r ri ib bo os so om me e 出出现现 l le ea ak ky y s sc ca an n 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒 所以常带有较强的自我复制元件 如复制起始位点等 往往克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒 所以常带有较强的自我复制元件 如复制起始位点等 往往 在菌体内存在多拷贝 所以抽质粒会抽出一大堆 但不具备表达元件 而表达质粒有复杂的构成 为的是在菌体内存在多拷贝 所以抽质粒会抽出一大堆 但不具备表达元件 而表达质粒有复杂的构成 为的是 控制目标蛋白的表达 如各种启动子 控制目标蛋白的表达 如各种启动子 T7 调节子 调节子 LacZ 等 而且以 等 而且以 pET 为代表的表达载体在菌体为代表的表达载体在菌体 内都是低拷贝的 防止渗漏表达 内都是低拷贝的 防止渗漏表达 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了 不管读码框什么的 但是表达载体是不但要你的目的克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了 不管读码框什么的 但是表达载体是不但要你的目的 基因连在上面 而且要表达蛋白 所以就要求你的读码框不能乱了 否则就不能得到你想到的表达产物 基因连在上面 而且要表达蛋白 所以就要求你的读码框不能乱了 否则就不能得到你想到的表达产物 1 载体即要把一个有用的基因 目的基因载体即要把一个有用的基因 目的基因 研究或应用基因 通过基因工程手段送到生物细胞 受体细研究或应用基因 通过基因工程手段送到生物细胞 受体细 胞 需要运载工具 交通工具 携带外源基因进入受体细胞 这种运载工具就叫做载体 胞 需要运载工具 交通工具 携带外源基因进入受体细胞 这种运载工具就叫做载体 vector 2 载体的分类载体的分类 按功能分成 按功能分成 1 克隆载体 克隆载体 都有一个松弛的复制子 能带动外源基因 在宿主细胞中复制扩增 它是都有一个松弛的复制子 能带动外源基因 在宿主细胞中复制扩增 它是 用来克隆和扩增用来克隆和扩增 DNA 片段 基因 的载体 片段 基因 的载体 2 表达载体 表达载体 具有克隆载体的基本元件 具有克隆载体的基本元件 ori Ampr Mcs 等 还具有转录等 还具有转录 翻译所必需的翻译所必需的 DNA 顺序的载体 顺序的载体 按进入受体细胞类型分 按进入受体细胞类型分 1 原核载体 原核载体 2 真核载体 真核载体 3 穿梭载体 穿梭载体 sbuttle vector 指在两种宿指在两种宿 主生物体内复制的载体分子 因而可以运载目的基因 穿梭往返两种生物之间 主生物体内复制的载体分子 因而可以运载目的基因 穿梭往返两种生物之间 克隆载体克隆载体 顾名思义就是质粒拷贝数比较高顾名思义就是质粒拷贝数比较高 在做上游克隆时比较方便在做上游克隆时比较方便 其重点在于质粒的复制其重点在于质粒的复制 问题 问题 基因工程中有克隆载体和表达载体 克隆载体可以在受体菌中大量复制 基因工程中有克隆载体和表达载体 克隆载体可以在受体菌中大量复制 表达载体用于表达目的蛋白 那么实际应用中 我们的最终目的是要得到目的表达载体用于表达目的蛋白 那么实际应用中 我们的最终目的是要得到目的 蛋白 克隆载体不能完成表达 有何用呢 还是说利用克隆载体实现目的基因蛋白 克隆载体不能完成表达 有何用呢 还是说利用克隆载体实现目的基因 的大量复制后 再将其转移到表达载体中实现表达 它是否有何缺陷不能整合的大量复制后 再将其转移到表达载体中实现表达 它是否有何缺陷不能整合 克隆载体的功能 构建兼有克隆和表达双重功能的载体有何困难 克隆载体的功能 构建兼有克隆和表达双重功能的载体有何困难 1 1 克隆的目的比较单一 就是将你感兴趣的克隆的目的比较单一 就是将你感兴趣的 DNADNA 片段 重组进入载体 然后于片段 重组进入载体 然后于 宿主细胞中大量繁殖 主要用于各种文库的建立 比如人类基因组计划 同时宿主细胞中大量繁殖 主要用于各种文库的建立 比如人类基因组计划 同时 由于载体所能容纳的目的片段的长度是有限的 而克隆载体没有表达所需的各由于载体所能容纳的目的片段的长度是有限的 而克隆载体没有表达所需的各 种片段 所以可以容纳更长的目的片段 即可以克隆足够长的基因 效率更高 种片段 所以可以容纳更长的目的片段 即可以克隆足够长的基因 效率更高 2 2 重组重组 DNADNA 需要使用限制性内切酶 因此待克隆的目的片段两端必需有其识别需要使用限制性内切酶 因此待克隆的目的片段两端必需有其识别 位点 现在的位点 现在的 T AT A 克隆载体可以直接克隆克隆载体可以直接克隆 PCRPCR 产物 省去了两端加装识别位点产物 省去了两端加装识别位点 的设计 的设计 PCRPCR 效率就更高 效率就更高 3 3 表达载体的目的是多样化的 为了实现实际工作中的需要 不同的目的就要表达载体的目的是多样化的 为了实现实际工作中的需要 不同的目的就要 设计不同的载体 用表达载体克隆基因不是不可以 实际工作中要考虑更多 设计不同的载体 用表达载体克隆基因不是不可以 实际工作中要考虑更多 因此更复杂 因此更复杂 4 4 细菌摄取能量的能力是一定的 如果用来合成大量蛋白质 合成核酸就会少 细菌摄取能量的能力是一定的 如果用来合成大量蛋白质 合成核酸就会少 5 5 细菌承受的工作负荷也是有限的 给它的工作太多 效率必然低下 这和我细菌承受的工作负荷也是有限的 给它的工作太多 效率必然低下 这和我 们日常生活是一个道理 们日常生活是一个道理 原因很简单 不是不能 是完全可以 但是效率会低很多 所以我们一般的策原因很简单 不是不能 是完全可以 但是效率会低很多 所以我们一般的策 略是 将目的片段克隆于非常简单的克隆载体上 按照需要再亚克隆于可以满略是 将目的片段克隆于非常简单的克隆载体上 按照需要再亚克隆于可以满 足各种要求的表达载体上 回答的不是很系统 如有问题可以继续来信讨论 足各种要求的表达载体上 回答的不是很系统 如有问题可以继续来信讨论 希望对你有所帮助 希望对你有所帮助 1 1 T A T A 克隆载体可以直接克隆克隆载体可以直接克隆 PCRPCR 产物 省去了两端加装识别位点的设计 产物 省去了两端加装识别位点的设计 PCRPCR 效率就效率就 更高 更高 是什么意思 是什么意思 T AT A 克隆载体是克隆载体是 PUCPUC 载体的线性化后两端加了载体的线性化后两端加了 T T 而 而 TaqTaq 酶有在酶有在 PCRPCR 产物后随机加产物后随机加 A A 的的 特性 所以特性 所以 PCRPCR 产物直接可以接入产物直接可以接入 T T 载体 而经典的克隆载体 而经典的克隆 PCRPCR 产物需要限制性内切酶产物需要限制性内切酶 切割后接入载体 所以在设计切割后接入载体 所以在设计 PCRPCR 引物时两端要加酶的识别位点 而加装的序列与模引物时两端要加酶的识别位点 而加装的序列与模 板不配对 因此板不配对 因此 PCRPCR 效率会低很多 效率会低很多 2 2 克隆载体只是为了得到大量的目的基因 而现在多用克隆载体只是为了得到大量的目的基因 而现在多用 PCRPCR 就可以达到这个目的 那这就可以达到这个目的 那这 个目的基因的主要用途是什么 只用来测序吗 表达载体应该兼有克隆与表达的功能个目的基因的主要用途是什么 只用来测序吗 表达载体应该兼有克隆与表达的功能 的吧 的吧 嗯 基本是这个意思 就测序不克隆也可以进行 克隆到载体的嗯 基本是这个意思 就测序不克隆也可以进行 克隆到载体的 CMSCMS 中就在基因两端中就在基因两端 有了可供你选择的很多限制性酶切位点 方便亚克隆到各种表达载体上 当然表达载有了可供你选择的很多限制性酶切位点 方便亚克隆到各种表达载体上 当然表达载 体可以克隆 但是效率低于克隆载体 一是因为表达载体不能直接克隆体可以克隆 但是效率低于克隆载体 一是因为表达载体不能直接克隆 PCRPCR 产物 必产物 必 须加装限制性酶切识别序列 上面已经讲过 二是表达载体的选择相对克隆载体是更须加装限制性酶切识别序列 上面已经讲过 二是表达载体的选择相对克隆载体是更 加严谨型的质粒 就是每个细菌里的拷贝数较低 能量守恒 细菌摄取能量的能力是加严谨型的质粒 就是每个细菌里的拷贝数较低 能量守恒 细菌摄取能量的能力是 一定的 用来合成蛋白质 核酸的合成必然受一定得限制 一定的 用来合成蛋白质 核酸的合成必然受一定得限制 3 3 我要构建一个基因的载体 我要构建一个基因的载体 1 1 我可以将目的基因 我可以将目的基因 1 3kb1 3kb 左右 和表达载体分别作酶切后连接吗 这几天将目的左右 和表达载体分别作酶切后连接吗 这几天将目的 基基 因做了一个因做了一个 T T 载体连接 可是不知道下一步怎么利用 载体连接 可是不知道下一步怎么利用 2 2 设计引物的时候用了设计引物的时候用了 sac1sac1 和和 hind111hind111 做 做 pcrpcr 的时候可以用的时候可以用 pfupfu 酶吗 酶吗 pfupfu 酶是必酶是必 须的吗 须的吗 3 3