园艺作物的繁殖有性繁殖

1 第五章 园艺作物的繁殖 第一节 有性繁殖 有性繁殖是利用植物种子培育幼苗的繁殖方式 其优点是 种子来源广 易于大量繁殖 幼 苗主根系发达 对环境适应性强 种子轻便 在采收 贮藏 运输及播种等一系列工作简便易行 缺点是 后代易出现变异 木本植物及某些多年生草本植物采用种子繁殖的植株开花结实较晚 一 种子的采集 1 种子采集的原则 应选择生长健壮 无病虫害 无机械损伤的植株作为采种母株 并选择其中生长发育良好且具 有品种典型性状的果实为种源 另外 采种工作切忌提早进行 以免种子成熟度不够 影响到种子 质量与发芽率 但是 有些具有胎萌现象作物 采种工作不能过迟进行 否则 种子可能在母体内 萌发 2 采种时期与方法 采种时期 对于自然裂开 落地或因成熟而易开裂的果实 须在果实熟透前收获 经晾晒后取种 干燥 对于肉质果内的种子 须在果实充分成熟并且足够软化后采集 以利于去掉肉质部分 采种方法 果实风干后 种子便可经揉搓 敲打 机械处理等后 自果实中脱出 肉质果实的种子需经发酵或机械的方法 去除果肉取出种子 二 种子的寿命与种子贮藏 一 种子的寿命 所谓种子寿命 是指种子生活力在一定的环境条件下所能保持的最长期限 一批种子的寿命是 指一个种子群体的生活力从种子收获降低到 50 所经历的时间 即种子群体平均寿命 又称种子的 平活期 但是 由于农业生产上需要的种子发芽率远高于 50 甚至高达 95 因此 农业种子 寿命的概念是 贮藏在一定环境条件下的种子能保持在母体植株上达到生理成熟时的生活力 而且 能长成正常植株的期限 二 种子的贮藏 1 普通贮藏法 开放贮藏法 将充分干燥的种子放置于麻袋 布袋 无毒塑料编织袋或缸 木箱等容器中 贮存于贮藏库里 由于不设密封装置 种子的温度 湿度 种子本身的含水量 往往随着贮藏库内的温湿度变化而变化 因而 为了延长种子寿命 应特别需要注意库内温湿度的调节 普通贮藏方法简单 经济 适合于贮藏大批量的生产用种 贮藏期限一般 1 2 年 3 年以上 则种子生活力明显下降 2 密封贮藏法 所谓种子密封贮藏法 是指把种子干燥到符合密封要求的含水量标准 再用各种不同的容器 或不透气的包装材料密封起来进行贮藏的方法 这种方法在一定的温度条件下 不仅能较长时间保 持种子的生活力 延长种子的寿命 而且便于交换和运输 3 真空贮藏法 真空贮藏法是将充分干燥的种子密封在近似于真空条件的容器内 使种子与外界隔绝 不受外 界湿度的影响 抑制种子的呼吸作用 保持种子处于休眠状态 从而达到延长种子寿命 提高种子 使用年限的目的 这是一种很有发展前途的贮藏方法 尤其是用于植物育种原始材料的贮藏 4 低温除湿贮藏法 低温除湿贮藏法是在大型种子贮藏库中装备冷冻 除湿设施 把库内温度降到 15 以下 相 2 对湿度降到 50 以下 以延长种子寿命 5 超低温贮藏 利用液态氮气可达 196 的低温 在如此低的温度下 代谢作用几乎停止 故若种子能在结 冰及解冻时存活 则可作永久性保存 三 种子包衣 种子包衣技术根据所用材料性质 固体或液体 的不同 分为种子丸化技术和种子包膜技术 种子丸化技术是通过机械处理将特制的丸化材料包裹在种子表面 并加工成外表光滑 整齐一 致的颗粒化种丸 种子包膜技术是将种子与特制的种衣剂按一定的药种比充分搅拌混合 使每粒种子表面均匀地 涂上一层药膜 形成包膜种子 种子包衣技术与传统的种子处理技术相比具有许多不可比拟的优点 确保苗全 苗齐 苗壮 省种省药 降低生产成本 利于保护环境 利于提高种子商品性 利于机械化播种 一 种子丸化技术 本文摘选自 1 种子丸化材料 主要包括三部分 惰性填料 活性物质 粘合剂 惰性填料主要包括粘土 硅藻土 泥炭 云母 蛭石 珍珠岩 铝钒土 淀粉 砂 石膏 活 性炭 纤维素 磷矿粉 硅石 水溶性多聚物等 这些惰性填料中有些材料不仅仅是作为填料 同 时还起到保护 供氧 改善土壤条件等作用 活性物质主要包括杀菌剂 克菌丹 福美双等 抗菌素 杀虫剂 化肥 菌肥 植物生长调 节剂等 粘合剂主要有羧甲基纤维素 CMC 甲基纤维素 乙基纤维素 阿拉伯树胶 聚乙烯醇 PVA 聚乙烯醋酸纤维 盐 石蜡 淀粉类物质 朊藻酸钠 聚偏二氯乙烯 PVDC 藻胶 琼脂 树脂 聚丙烯酰胺等 另外 因为丸化材料本身带菌或操作过程中造成污染 必须加入防腐剂 为了区分不同品种 的种子 须加入着色剂 常用染料有胭脂红 柠檬黄 靛蓝三种 2 种子丸化的加工工艺 种子丸化的加工工艺是种子丸化技术中的一个重要环节 丸化质量的 好坏直接影响种子的质量 被丸化的种子需经过精选 种子质量必须达到国家一级种子标准 机械 加工一般选用旋转法或漂浮法 种子丸化机械国外有多种机型 由电机座 电机 减速箱 滚动罐 气泵 喷雾装置形成 种子丸化过程可分四个时期 成核期 种子放入滚动罐中匀速滚动 同时向罐内喷水雾 待种子表面潮湿后 加入少量粉 料 在滚动中粉料均匀地包在种子外面 重复上述操作 形成以种子为核心的小球 杀虫剂 杀菌 剂一般在此阶段加入 丸粒加大期 罐内改喷雾状粘合剂 同时投入粉料 化肥及生长调节剂等混合物 喷粘合剂 和加粉料要做到少量多次 直至接近要求的种子粒径 滚圆期 此期仍向罐内喷雾状粘合剂 同时投入较前二个时期更细的粉料 吹热风并延长滚 动时间 以增加丸粒外壳的圆度和紧实度 待大部分丸粒达到要求后 停机取出种子过筛 除去过 大过小的丸粒种子 种渣 光染色期 将过筛后的种子放回滚动罐中 加入滑石剂和染色剂 不断滚动 使种子外壳有 较高的硬度 光滑度 并用不同颜色加以区分 二 种子包膜技术 1 种衣剂 3 种衣剂是用成膜剂等配套助剂制成的乳糊状新剂型 种衣剂借助成膜剂粘着在种子上 很快固 化成均匀的薄膜 不易脱落 种衣剂有四大类 物理型 化学型 药肥型 生物型 激素型 和特异型 逸氧 吸水功能 等 种衣剂的主要成分包括 活性组合 农药 肥料 激素 胶体分散剂 聚醋酸乙烯酯与聚乙 烯醇的聚合物等 成膜剂 PVAC PVRN 等 渗透剂 异辛基琥珀酸磺酸钠等 悬浮剂 苯乙基 酚聚氧乙基醚等 稳定剂 硫酸等 防腐剂 填料 警戒色等 2 种子包膜的加工工艺及流程 种子从喂料口进入包衣机 种子甩盘使种子幕状分布 包衣药剂通过剂量泵进入甩盘 甩盘 使药剂均匀雾化并与种子充分接触 搅拌器使药剂包在种粒上 四 种子休眠与发芽 一 种子的休眠与萌发 由于种子本身的生理因素所造成的延迟发芽的现象在种子学上称为种子休眠 种子休眠特性是植物在长期的进化过程中自然淘汰与适应生态环境的综合结果 对于物种繁 衍具有特殊意义 引起种子休眠的原因是多方面的 它们相互作用 共同抑制种子萌发进程 即使其中一种因素 被解除 其他因素可以依然会导致种子不能发芽 种胚发育情况 种子后熟 种皮的不透水性 种皮的不透气性 种皮的机械作用 发芽抑制物质 二 打破种子休眠 1 物理机械处理法 温度处理 低温冷冻处理 高温干燥处理 适温热水浸种 变温处理等 机械处理 2 化学物质处理法 无机化学药物处理 浓硫酸 硼酸 盐酸 碘化钾 硝酸铵 碳酸氢钠 氯化钠 双氧水 H2O2 等 有机化学药物处理 硫脲 尿素 过氧化氢络合物 胡敏酸钠 秋水仙精 甲醛 乙醇 丙 酮 对苯二酚 单片酸 甲基蓝 羟胺 丙氨酸 谷氨酸 反丁烯二酸 苹果酸 琥珀酸 酒石酸 2 氧戊二酸等等 3 植物生长调节剂处理法 赤霉素 细胞分裂素 乙烯利 壳梭孢菌素 FC 4 气体处理法 1 氧气 通常提高氧气的浓度可以促进休眠种子的复苏 提高发芽能力 2 二氧化碳 一氧化碳 氮气等 通常二氧化碳浓度增加会导致种子休眠 抑制种子发芽 但在有些情况下 高浓度二氧化碳却有相反的结果 二氧化碳与乙烯利同样也能促进莴苣种子发芽 与氰氢酸等化合物一样 二氧化碳 一氧化碳 氮气等作为有氧呼吸阻碍剂也具有打破各种种子休 眠的作用 三 种子的萌发 4 当具有生命力的种子通过或解除了造成休眠的因素之后 在一定条件下 种子的胚便由休眠状 态转变为活动状态 开始生长 胚根突破种皮 胚芽向上生长 发育成为新个体 这个过程称之为 萌发 1 种子萌发过程 种子萌发可以分为吸胀 萌动和生长三个阶段 1 吸胀 物理阶段 根据种子吸收水分的过程 一般可以分成两个阶段 第一阶段为急 剧吸水阶段 这一过程一般为 2 3 小时 第二阶段为缓慢吸水阶段 这一过程一般为 5 10 小时 种子的吸胀纯粹是一种物理过程 因此即使是枯死的种子也可以发生吸胀作用 2 萌动 生化阶段 吸胀后的种子 酶活性增加 在酶的作用下 贮藏物质水解为简单 的化合物供胚吸收 内部的新陈代谢作用加强 细胞开始分裂 进入萌动状态的种子 对外界条件 的反应极为敏感 当外界环境条件发生变化 特别是受到各种不良理化因素的刺激 就会引起生理 失调 导致萌发停止或迫使进入第二次休眠 3 生长 生理阶段 种子萌动后 胚细胞的分裂速度急剧加快 胚的体积迅速增大 最 后胚根尖端突破种皮 顺着发芽孔外伸 开始生长 胚根微露后 幼根细胞吸水膨大 种子再次吸水 随主根伸长生长 侧根发生 并发生大量根毛 从培养基质中吸收无机营养 胚轴的生长 子叶脱离种皮 露出幼小的胚芽 光照条件下 暴露的子叶开始合成叶绿素 黄化的子叶逐渐变绿 并且开始进行光合作用 五 播种技术 一 催芽 在播种前将吸水膨胀的植物种子放在适宜发芽的温度下促进其发芽的技术叫做催芽 催芽可在恒温箱中进行 也可在温床 催芽室内进行 催芽的温度可以是恒温 也可以是变温 催芽过程中应该保持种子湿润并经常性地翻动种子 以改善其通气条件 待胚根突破种皮 长度约 0 5cm 时即可播种 二 播种 1 播种季节与播种期 一般适宜播种期是 定植期减去秧苗苗龄 即可向前推算日期 不同 种类作物苗龄不同 同一种作物苗龄因育苗设施 环境条件不同也有变化 2 播种量 播种量确定需考虑到种子的净度 发芽率以及苗床的温度条件 同时还取决于移 栽时秧苗的大小 另外 若考虑到病虫危害 鼠害等因素 可适当增大播种量 一般可由以下公式计算 播种量 g m2 每平方米株数 每克重种子粒数 发芽率 净度 成苗率 其中 成苗率 种子出苗数 发芽数 3 播种 播种前整平苗床床土 用喷壶浇足 底水 使床土 6 10cm 土层湿润 底水不可过 大 以免引起土壤板结 但床土过干也会影响出苗 冬季地温较低 浇水不可过多 以免降低土壤 温度 同时会引发病害 甚至烂种 4 播种方式 撒播 条播 宽窄行播 点播 5 覆土 播种后应立即盖一层土或基质 即 盖籽土 以保持床土水分 防止过分蒸发 同 时还有助于子叶脱壳出苗 盖籽土应采用疏松的营养土或基质 有时为防止苗期病虫害 亦可盖上 拌过药剂的药土 覆土厚度一般为种子大小的 3 5 倍 5 第二节第二节 无性繁殖无性繁殖 利用植物营养器官 包括根 茎 叶等 的一部分 通过一定技术处理 促使细胞分裂和组织 器官分化 形成一个新的完整的植株的繁殖方式称为无性繁殖 也叫营养繁殖 营养繁殖方法主要有扦插 压条 分株和嫁接 一 扦插繁殖 扦插是人为剪取植株的部分营养器官 如根 茎或叶 插入土壤或其它育苗基质 包括水 空气 中 在适宜的环境条件下培育成完整植株的技术 一 枝条扦插 枝条扦插一年四季均可进行 但生产上主要集中于春季和夏秋季 1 硬枝扦插 冬季落叶植物的硬枝扦插一般采用头一年冬季修剪时收集的成熟枝条 每根枝条都剪成 50cm 左右 然后 50 100 根一捆 用塑料绳绑好 系上标签 斜埋于避风向阳 排水良好 土质疏松的 田间或具有一定湿度的河沙中 以防止冬季低温对枝条的伤害 埋土时应注意枝头朝南 既可以防 止寒风侵害 又可避免冬季日烧 贮藏期间的温度应保持在 1 5 之间 露地扦插一般于每年 3 4 月间进行 但是不同地区稍有差异 其原则是土壤温度已稳定于 10 以上 而枝条上的芽尚未开始萌动 苗床准备 包括土地平整 施肥 作畦等 枝条剪切 剪成 10 15cm 的枝段 每段含 3 4 个健康叶芽 激素处理 NAA 或 IBA 使用的浓度一般为 1000mg L 扦插密度 扦插的株行距为 20 30cm 苗床管理 适当控制土壤水分有利于插条生根 中午进行必要的遮荫或叶面喷水 雾 2 绿枝扦插 当年生新梢进行绿枝扦插 一般在每年 7 9 月份进行 扦插时间不宜过早过迟 绿枝扦插的优点是扦插期间土温较高 有利于不定根发生 本身是处于生长状态的枝条 带有 叶片 过氧化物酶活性高 还可以合成碳水化合物 维生素 植物激素 如吲哚乙酸 多胺等 等 生根必需物质 有利于发根 枝条木质化程度较低 有利于不定根突破枝皮向外生长 缺点是夏秋 季气温高 叶面蒸腾量大 枝段容易失水导致扦插失败 具体做法是 剪去枝段上部分叶片 仅保留基部成熟度较高的 2 3 叶片叶柄或极少量的叶片组织 白天大部分时间内对扦插苗床进行遮荫处理 减少阳光直射 降低叶面温度 定时或不定时对叶片喷雾 增加空气湿度 防止叶片失水 二 根插法 有些植物 虽然枝条扦插不易发生不定根 但是若用根系扦插 在一定条件下可以发生不定芽 根段采集一般于秋冬季深翻改土或施肥时进行 将收集的根系剪成 15 20cm 长 50 100 根 一梱 沙藏于田间 待开春后扦插 三 叶插法 一些叶柄粗壮 叶脉或叶片肥厚的园艺植物 主要是花卉 如落地生根 秋海棠 大岩桐 非洲紫罗兰 虎尾兰 豆瓣绿等 能够从叶片上发生不定根和不定芽 将整张叶片或部分叶片平插 或直插入基质中 在一定的温湿条件下可以形成新的植株 四 影响扦插成活的因素 不同物种之间扦插成活的难易程度是不一样的 枝条的生理状态影响到生根的难易 6 枝条的营养物质含量影响到扦插生根 不定根的发生与茎段中生长素 多胺等的含量有关 同时还与过氧化物酶活性以及酚类物质有关 扦插前用植物生长调节剂处理已经成为一项常规的技术手段 对插条进行一定的机械处理 如剥皮 刻伤 以加大对细胞的刺激力度 或者将硬枝进行黄化 处理 以软化组织 活化细胞 都有利于不定根的发生 影响插条生根的外部环境主要包括温度 湿度 通气条件和光照 二 压条繁殖 压条是指在植物枝条不离开母体的情况下 将其埋下土中或其它的湿润基质中 诱导产生 不定根后 再与母株分离 形成一个新的独立的植株的繁殖技术 压条过程中 母体植株能够为发根部位提供必要的水分养分 受到外界不良环境条件影响 较少 因而生根相对容易 但是压条的缺点是繁殖系数低 对母株有伤害 一般用于扦插不易生根 的物种 压条繁殖可以分为地面压条和空中压条两种 一 地面压条 所谓地面压条是指将植物枝条压入潮湿的泥土中 诱导产生不定根 然后将枝条连根系一起剪 离母体 从而成为一个独立的新植株 地面压条根据枝条压入土中的方式不同 又分为直立压条和曲枝压条两种 二 空中压条 空中压条又称为中国压条 高空压条 简称为高压 主要用于我国南方常绿植物如柑橘 荔 枝 龙眼 枇杷 油梨 树菠萝 桂花等的无性繁殖 其特点是成活率高 技术简易 空中压条在整个生长季节中均可进行 而以春季和雨季最多 高压 2 3 年生的充实健壮枝 并将压条部位枝条环剥一圈 宽度 2 4cm 再用潮湿的锯木屑 苔藓 稻草 园土等填充保湿材 料包着环剥部位 最后用塑料薄膜 油纸等包裹 塑料绳绑扎 2 个月后即可生根 冬季来临前剪 离母株 并假植于苗圃内 待幼苗生长一年后再出圃 三 分株繁殖法 分株繁殖一般用于能够产生根蘖 匍匐茎或吸芽的物种 1 根蘖分株法 枣 山楂 树莓 樱桃 李 石榴 杜梨 山定子 海棠果 万年青等物种根系 在自然条件 或外界刺激下可以产生大量的不定芽 当这些不定芽发出新的枝条后 连同根系一起剪离母体 成 为一个独立植株 这种繁殖方式称为根蘖繁殖 所产生的幼苗称为根蘖苗 2 吸芽分株法 香蕉植株地下茎在生长季节可以抽生吸芽 菠萝植株地上茎叶腋间也能抽生吸芽 并在基部 产生不定根 将吸芽与母株分开 便可培育出与母株遗传性一致的无性系幼苗 3 匍匐茎或走茎分株法 草莓以及草坪草 如狗牙根 野牛草等 地上茎的腋芽在生长季节能够萌发出一段细的匍 匐于地面的变态茎 被称为匍匐茎 匍匐茎的节位上能够发生叶簇和芽 下部与土壤接触 能长出 不定根 夏末秋初 将匍匐茎剪断 得到独立的幼苗 虎耳草 吊兰等叶腋间能长出一段较长的不 贴地面的变态茎 被称为走茎 走茎的节上也能产生不定根和叶簇 分离后栽植即可成为新植株 四 特殊营养器官繁殖 一些园艺作物具有产生变态根 如块根 或变态茎 如鳞茎 球茎 根茎 块茎等 的 特性 利用这些变态营养器官 可以培育出遗传特性一致的无性系后代幼苗 1 块根繁殖 2 块茎繁殖 3 根茎繁殖 4 球茎繁殖 7 5 鳞茎繁殖 五 嫁接繁殖 将植物优良品种的芽或枝条转接到另一个植株个体的茎或根上 并使之愈合成为新的独立植株 的技术称为嫁接 嫁接过程中 被嫁接的植株部分如果是芽 则称为接芽 如果是茎段 则称为接 穗 接受接穗 芽 的植株 称为砧木 砧木可以是根段 也可以是幼苗 还可以是大树体 通过 嫁接方法培育出来的幼苗 称为嫁接苗 一 嫁接的意义 提高植株整体对环境的适应性 促使果树提早结果 改变树体生长特性 提早结果 增加产量 改善品质 使雌雄异株变成雌雄同株 或者一株多品种 从而减少人工授粉用工量 恢复植株生长 延长经济寿命 高接换种 有利于果树新品种推广利用 提高观赏植物的观赏价值 在作物育种中 为了克服植物远缘杂交不亲合问题 二 嫁接方法 1 T 字形芽接 主要用于果树的苗木繁殖 见图 5 7 主要集中于 6 9 月份进行 嫁接过程大致可分为 切芽 切砧木 取芽 插入芽片 绑缚 同时注意将叶柄保留于外 以 便在 1 2 周后检查嫁接成活率 一般地 若芽体新鲜 叶柄一触即落 说明已经嫁接成活 否则 说明未成活 需要补接 补接可以立即进行 但是若时机已不合适芽接 也可以在来春进行枝接 2 插芽接法 用于草本园艺作物幼苗繁殖 图 5 8 选用与接穗粗细相同的竹签或其它器具在砧木顶端或下胚 轴子叶节处 瓜类 第一或第二片真叶上方叶腋处 茄果类 插一小孔 然后选择适当接穗 削成楔 形 插入砧木孔中 使砧木与接穗紧密吻合 再用夹子固定 3 劈接 切接法 既用于木本也用于草本植物幼苗繁殖 如果从中间劈开砧木并插入接穗 称为劈接 图 5 10 如果从砧木一侧切开插入接穗 称为切接 图 5 11 其原理基本相同 操作时 先将砧木枝条 茎部 平剪 再用枝接刀从中间 或一侧 向下切开 再将接穗两侧各削一刀 成双面楔 然后垂 直插入砧木切口处 并至少使接穗与砧木的形成层一面吻合 最后 用夹子固定 草本 或用塑料 薄膜绑缚 木本 4 腹接法 常用于木本植物的繁殖 接穗的削取与切接等方法相似 只是削口稍短些 另外 切砧木时用 枝接刀在枝条节间 腹部 斜下切一刀 然后插入接穗 绑缚 5 靠接法 瓜类幼苗靠接时 先切去砧木真叶及生长点 在下胚轴离子叶节 0 5 1 0cm 处 用刀片自上而 下斜切一长的切口 下刀方向与下胚轴呈 30 40 然后将接穗连根拔起 在其下胚轴子叶节 下方由下向上斜切一刀 切口长度与砧木切口长度相仿 最后将接穗舌形楔插入砧木的切口中 茄 果类嫁接时的部位是第一和第二片真叶之间 将二株幼苗按切口嵌合 并使接穗子叶压在砧木子 叶上面 固定 成活后 再将接穗下胚轴切断 木本植物靠接时 将栽植于相邻的两株植物 接穗与砧木 相对部位各削一个大小相同的伤口 长 度约 3cm 将两者靠到一起 并使伤口形成层对齐 然后用塑料薄膜绑扎结实 当两者愈合后 将 接穗植株的根系以及砧木植株嫁接口以上枝条一同剪去 接穗与砧木便形成一个新的独立植株 三 影响嫁接成活的因素 亲和性 砧穗之间的亲和性由其遗传性决定的 系统发育中亲缘关系越相近的砧穗组合 8 嫁接亲和性越好 生理状态 砧木植株生理状态越活跃 嫁接口越容易愈合 接穗上芽相对静止有利于嫁接成 活 砧穗质量 接穗健壮充实 芽体饱和 同时砧木粗度应等于或大于接穗 温度 主要影响到细胞分裂以及嫁接口愈合 嫁接应安排在温度合适的季节内进行 湿度 三种湿度因素影响到嫁接成活 其一是土壤湿度 主要影响到在砧木根系活动 其二 是大气湿度 空气保持较高湿度但又不出现阴雨绵绵的气候条件有利于嫁接成活 其三是嫁接口湿 度 这是嫁接成活的关键 利用塑料薄膜绑扎保湿 减少嫁接口水分丧失 是细胞分裂和接口愈合 的前体 嫁接技术 嫁接过程中 接口切削的平滑度 砧穗形成层的对齐程度以及嫁接速度等影响到 嫁接成活 因而 要求嫁接工具锋利 用力得当 动作准确 操作熟练 四 嫁接苗的管理 温度管理 瓜类嫁接苗愈合的适宜温度为白天 25 28 夜间 16 20 茄果类白天 25 26 夜间 16 19 温度过低或过高均不利于接口愈合 湿度管理 嫁接伤口愈合前 须常浇水 减少蒸发 使空气湿度保持在 90 以上 待成活后 再转入正常湿度管理 光照调控 嫁接后 3 4 天内需要全遮光处理 以防产生高温 同时也能保持较高湿度 全遮 光后应逐渐改为早晚见光 并随着愈合过程进行 不断增加光照时间 CO2与激素处理 CO2的增加使幼苗光合作用增强 可以促进嫁接部位组织的融合 另外 嫁 接口用一定浓度外源激素处理 也可明显地提高嫁接苗的成活率 第三节组织培养繁殖第三节组织培养繁殖 一 植物组织培养的基本概念一 植物组织培养的基本概念 所谓植物组织培养 是指在人工控制的条件下 将植物体的任何一部分 或器官 或组织 或 细胞进行离体培养 使之发育形成完整的植物体 所谓人工控制的条件 即营养条件和环境条件 植物体的任何一部分系根 茎 叶 花 果以及它们的组织切片和细胞 在植物组织培养中 从活体植物体上切取用于进行培养的那部分无菌细胞 组织或器官叫做外 植体 外植体通常都是多细胞的 并且这些细胞包括不同的类型 因此由一个外植体诱导形成的愈 伤组织也常常是异质性的 其中不同类型细胞形成完整植株的再分化能力或再生能力有所不同 一 个成熟的植物细胞经历了脱分化之后 即形成愈伤组织之后 由愈伤组织能再形成完整的植株 这 一过程叫做再分化 那么 一个脱分化的植物细胞 为什么能够再生成完整的植株呢 是因为植物细胞具有全能性 所谓细胞全能性 是指任何具有完整细胞核的植物细胞 都拥有形成一个完整植株所必需的全部遗 传信息 因此 对于植物细胞来说 不仅受精卵 体细胞也具有全能性 对于动物细胞来说 随着 新近克隆羊 克隆牛等的相继成功 也证实了动物体细胞的全能性 由脱分化的细胞再分化形成完整植株有两种途径 一种是器官发生方式 即在愈伤组织的不同 部位分别独立形成不定根和不定芽 另一种是胚胎发生方式 即在愈伤组织表面或内部形成类似于 合子胚的结构 我们称其为体细胞胚 或不定胚 或胚状体 体细胞胚胎发生所经历的发育阶段与 合子胚相似 一般经球形胚 心形胚 鱼雷形胚和子叶胚 4 个发育阶段 一般认为 愈伤组织中的 不定芽起源于一个以上的细胞 而体细胞胚只源于一个细胞 因此由体细胞胚发育形成的植株的各 9 部分在遗传组成上应当是一致的 不存在嵌合体现象 综上所述 植物组织培养的过程可以简单地表示如下 图 1 脱分化 外植体 细胞 愈伤组织 再 分 化 完整植株 不定器官 体细胞胚 图 1 植物组织培养的过程示意图 二 植物组织培养在农业生产中的应用 1 在植物育种中的应用 植物组织培养已广泛应用于植物育种 在单倍体育种 胚培养 体细胞杂交 细胞突变体筛选 遗传转化等方面均取得了显著成就 在单倍体育种方面 自从 Guha 和 Maheshwari 1964 获得世界上第一株花粉单倍体植株以 来 目前世界上已有约 300 种植物成功地获得了花粉植株 通过花药 花粉 培养获得单倍体植株 然后经秋水仙素处理使其染色体加倍 可以迅速使后代基因型纯合 加速育种进程 通过花药培养 1974 年我国科学家育成了世界上第一个作物新品种 烟草品种单育 1 号 之后又育成水稻中花 8 号 小麦京花 1 号等一批优良品种 胚 胚胎 培养早在 20 世纪 40 年代就开始用于克服植物远缘杂交不亲和性 采用幼胚 或胚 胎 胚珠等 离体培养使自然条件下早夭的幼胚发育成熟 获得杂种后代 目前已在 50 多科属中 获得成功 体细胞杂交可打破物种间生殖隔离 实现有益基因的交流 是改良植物品种 并创造新类型的 有效途径 通过体细胞杂交 目前已选育细胞质雄性不育烟草和水稻 马铃薯栽培种及其野生种的 杂种 番茄栽培种及其野生种的杂种 甘薯栽培种及其野生种的杂种 马铃薯与番茄的杂种 甘蓝 与白菜的杂种 柑橘类杂种等一批新品种 系 和育种新材料 用遗传转化即基因工程方法 解决传统育种方法所不能解决的问题 并与常规方法有机相结合 建立高效育种技术是目前世界共同努力的方向 基因工程已成为改良植物抗病虫性 抗逆性及品质 等方面新的重要手段 通过这种方法 目前已获得抗虫棉等一批农作物新品种 并已在生产上大面 积推广应用 2 在植物脱毒和离体快繁中的应用 植物脱毒和离体快繁是目前植物细胞组织培养应用最多 最有效的一个方面 许多植物 特别 是无性繁殖植物均受到多种病毒的侵染 造成严重的品种退化 产量降低 品质变劣 利用这种方 法 目前已在马铃薯 甘薯 草莓 大蒜 苹果 香蕉等多种主要作物上大规模生产脱毒种苗 植物离体繁殖的突出优点是快速 材料来源单一 遗传背景均一且不受季节和地区等条件的限 制 重复性好 离体快繁比常规方法快数万倍至百万倍 目前 世界上已建立了许多组培工厂 成 10 为一个新兴产业 离体快繁技术已在观赏植物 园艺植物 经济林木 无性繁殖作物等上广泛应用 3 在次生代谢产物生产中的应用 利用植物细胞组织的大规模培养 可以高效生产各种天然代谢产物 如蛋白质 脂肪 糖类 药物 香料 生物碱 天然色素以及其它活性物质 因此 近年来这一领域已引起人们的广泛兴趣 和高度重视 国际上已获得这方面专利 100 余项 例如 用细胞培养生产蛋白质 将给饲料和食品 工业提供广阔的原料生产前景 用组织培养生产人工不能合成的药物或有效成分等的研究正在不断 深入 有些已开始工厂化生产 4 在植物种质资源保存和交换中的应用 植物种质资源一方面不断大量增加 另一方面一些珍贵 濒危植物资源又日趋枯竭 造成田间 保存耗资巨大 又导致有益基因的不断丧失 利用植物组织培养进行离体低温或冷冻保存 可大大 节约人力 物力和土地 还可挽救那些濒危物种 同时 离体保存的材料不受病虫害侵染且季节的 限制 有利于种质资源的地区间及国际间的交换 5 在遗传 生理 生化 病理等研究中的应用 植物细胞组织培养的发展推动了植物遗传 生理生化和病理学的研究 已成为植物科学研究中 的常规技术 利用花药培养获得纯合二倍体植株 是开展基因的性质和作用 染色体组同源性等遗 传研究的理想材料 利用细胞培养中引起染色体的变化 得到植物的附加系 代换系 易位系等 将为染色体工程研究开辟新途径 植物组织培养也为植物生理活动研究提供了一个强有力手段 植物组织培养发展过程中曾在矿 质营养 有机营养 生长活性物质等方面开展了很多研究 有利于增进对植物营养问题的认识 在 细胞生化合成研究中 细胞组织培养也极为有用 如查明了尼古丁在烟草中的部位等 在植物病理 学研究中 可用单细胞或原生质体培养快速鉴定植物的抗病性 抗逆性等 总之 植物组织培养是生物工程的基础和关键环节之一 它在农业生产中的实际应用越来越广 泛 发挥的作用越来越重要 三 植物组织培养的基本技术三 植物组织培养的基本技术 植物组织培养是一项技术性较强的工作 为确保组织培养工作的顺利进行 达到无菌条件 就 必须保证与植物组织培养研究或试管苗商业化生产任务 规模及当地条件等相适应的硬件条件和软 件条件 硬件条件包括实验室与设施 环境 仪器 设备 器皿 器具等 软件条件就是指无菌操 作和管理体系 硬件配置是否符合植物组织培养的要求 将直接影响到植物组织培养的成败 1 植物组织培养实验室的组成 一个组织培养实验室的面积大小和装备程度取决于两个因素 一是所要进行的实验的性质 二 是所能得到的经费的多少 然而 一个标准的组织培养实验室就当具备进行下列工作所必需的设施 1 玻璃器皿 塑料器皿和其他实验器皿的清洗和贮存 2 培养基的制备 灭菌和贮存 3 植物材料的无菌操作 4 将培养物保持在温度 光照 可能时还有湿度的可控条件下 培 11 养物的观察 为此至少需要有两个隔开的房间 一间用于玻璃器皿的清洗和贮存 以及培养基的制 备 培养基室 第二间用于放置培养物 培养室 培养室内应放一张桌子 上置双筒解剖镜和所 需的光源 以便对培养物进行镜检 取决于本单位的条件 超净工作台可置于培养室中 也可置于 一个普通研究实验室内僻静的一角 当然最好是置于一个专门设计的接种室内 此外 还需要有一 个单独的天平室 学一般可与其他实验室共用 综合实验室 植物组织培养和试管苗生产所用的各种器具的洗涤 干燥和保存 药品的称量 溶解 配制 培养基的分装 包扎和灭菌 植物材料的预处理 培养材料的观察分析等操作都在综合实验室中进 行 接种室 植物材料的接种 培养物的转移 试管苗的继代培养等 均需在无菌的接种室进行 保证良好 的无菌条件 延长无菌状态持续的时间 是减轻污染的关键 培养室 培养室是人工条件下培养接种物及试管苗的场所 其大小可根据需要放置的培养架的大小 数 目及其他附属设备而定 其设计除一般要求外 应充分考虑利用空间 节省能源和充分采用自然光 照等原则 洗涤室 洗涤室用于玻璃器皿 实验用具和培养材料的清洗 灭菌室 用于玻璃器皿 小用具及培养基的灭菌消毒 玻璃器皿和小用具的消毒采用干热灭菌法 固体 培养基消毒采用高压灭菌法 而液体培养基消毒采用细菌过滤器 灭菌室内应有烘箱 高压锅 细 菌过滤器 灭菌釜等灭菌设备 还应配备水源 电源或燃气装置 鉴定室 用于细胞学和组织学观察 可根据需要和条件配备显微镜 解剖镜 恒温箱 切片机 烤片台 恒温水浴 滴瓶 染色缸 超速与高速离心机 核酸与蛋白质序列测定仪 分子成像仪 超速与高 速离心机 氨基酸成分分析仪 高压液相色谱仪 毛细管电泳仪 电激仪 PCR 仪和万能显微镜等 仪器设备 计算机系统 以计算机技术作为重要手段之一的信息技术 将全面应用于植物组织培养及生物技术领域 大 致可以归纳分类为 1 信息系统 如数据库系统 多媒体技术 生物信息学与基因组学等 2 决策系统 如规划系统 专家系统 模拟决策系统 模拟优化决策系统 3 监控系统 4 网络系统 贮存室 12 把暂时不用的器皿 用具等存放在贮存室内 也可以用作种质保存 驯化移植室 用于试管小植株的锻炼苗和移植 需备有温室 弥雾装置 荫棚 移植床 钵 盆 塑料布 草炭 蛭石 粗沙等 2 2 培养基培养基 植物组织培养中最主要的部分 在离体培养条件下 不同植物组织对营养的要求不同 甚至同 种植物不同部分的组织对营养的要求也不相同 只有满足了特殊的要求 它们的生长才能尽如人意 因此 没有任何一种培养基适合一切类型的植物组织和器官 在建立一项新的培养系统时 首先必 须筛选一种能满足该组织特殊需作的培养基 培养基的种类很多 不同的培养基有其自身的特点 通过分析了解它们的特点 可方便选择适宜的培养基 取得良好的实验效果 选择合适的培养基 选择合适的培养基是植物组织培养成功的基础 选择合适的培养基主要从以下两个方面考虑 一是基本培养基 二是各种激素的浓度及相对比例 在选择一种新的植物材料进行组织培养时 为 了能尽快建立起再生体系 最好选择一种基本培养基 MS 培养基适合于大多数双子叶植物 B5 和 N6 培养基适合于许多单子叶植物 特别是 N6 培养基对禾本科植物小麦 水稻等很有效 White 培养基适于根的培养 首先试用这些培养基进行初步实验 可以少走弯路 大大减少时间 人力和 物力的消耗 当通过一系列初试之后 可再根据实际情况对其中的某些成分做小范围调整 在进行 调整时 以下情况可供参考 一是当用一种化合物作为氮源时 硝酸盐的作用比铵盐好 但单独使 用硝酸盐会使培养基的 pH 向碱性方向漂移 若同时加入硝酸盐和少量铵盐 会使这种漂移得到克 服 二是当某些元素供应不足时 培养的植物会表现出一些症状 可根据症状加以调整 如氮不足 时 培养的组织常表现出花色苷的颜色 红 紫红色 愈伤组织内部很难看到导管分子的分化 当氮 钾或磷不足时 细胞会明显过度生长 形成一些十分蓬松 甚至是透明状的愈伤组织 铁 硫缺少时组织会失绿 细胞分裂停滞 愈伤组织出现褐色衰老症状 缺硼时细胞分裂趋势缓慢 过 度伸长 缺少锰或铝时细胞生长受到影响 培养基外源激素的作用也会使培养物出现上述一些类似 的情况 所以应仔细分析 不可轻易下结论 培养基的组分 是通过分析植物体的成分而制定的 一般培养基中常见的成分主要有以下几种 水 无机营养 成分 有机营养成分 植物生长调节物质 琼脂 pH 值 活性炭 硝酸银 抗生素 3 外植体 植物组织培养的成败除与培养基的组分有关外 另一个重要因素就是外植体本身 即由活体植 物上切取 用于离体培养的那部分组织或器官 为使外植体适于在离体培养条件下生长 有必要对 外植体加以选择和处理 外植体在接种之前 须经严格地灭菌 由于灭菌剂的种类不同 杀菌力不同 因此选择消毒剂 既要考虑具有良好的消毒杀菌作用 同时又易被蒸馏水冲洗掉或能自行分解的物质 且不会损伤或 13 只轻微损伤组织材料而不影响生长 在使用不同的药剂时 需要考虑使用浓度和处理时间 现将常用的消毒剂列于表 中 表 常用消毒剂 消毒剂使用质量分数 去除难易消毒时间 min 消毒效果有否毒害植物 次氯酸钙9 10易5 30很好低毒 次氯酸钠2易5 30很好无 过氧化氢10 12最易5 15好无 硝酸银1较难5 30好低毒 氯化汞0 1 1较难2 10最好剧毒 酒精70 75易0 2 2好有 抗生素4 50中30 60较好低毒 污染的发生与培养植物的基因型 外植体来源 分离季节 组织大小及操作人员的技术水平等 有关 取材组织越大越易污染 夏季取材比冬季取材带菌多 不同年份的污染情况也有所差异 组 织培养中要获得无菌材料 在综合上述情况的基础上 还要选择适宜的消毒剂 由于不同植物及同 一植物不同部位 有其不同的特点 它们对不同种类及其浓度的消毒剂敏感反应也不同 所以开始 要预备实验 以达到最佳的消毒效果 外植体消毒的步骤如下图 2 所示 外植体取材 自来水冲洗 70 酒精表面消毒 20 60s 无菌水冲洗 消毒剂处理 无菌水充分洗净 备用 图 2 外植体消毒步骤 一般情况下 如果外植体较大而且硬 可直接用消毒剂处理 如果实 叶片 茎段 种子等的 消毒 如果是幼嫩的茎尖 一般先取较大的茎尖 表面消毒后 再在无菌条件下借助解剖显微镜取 出需要的茎尖大小培养 如果是未成熟胚 胚珠 胚乳 花药等 一般先把子房或胚珠 花蕾表面 消毒 再在无菌条件下剥出需要的外植体 如果是细胞 应按培养目的 选择合适的起始材料进行 相应的外植体消毒 外植体接种 将消过毒的外植体在超净工作台上分离 切割成所需的材料大小并将其转移到培养基上的过程 即是外植体接种 1 接种室的消毒 为保证接种工作是在无菌条件下进行 应做到 每次接种前应清洁接 种室 可用 70 酒精喷雾使空气中的细菌和真菌孢子随灰尘的沉降而沉降 接种前 超净工作台 面用 70 酒精擦洗后 再用紫外灯照射 20min 接种使用的解剖刀 镊子 培养皿 三角瓶等要事 先经高压灭菌处理 操作中 使用过的镊子 解剖刀要经常在酒精灯上灼烧灭菌 14 2 无菌操作要求 操作人员使用的工作服 帽子 口罩等要经常保持干净 并定期进行 消毒 同时 在接种时应带上口罩 双手双臂也要用 70 酒精表面灭菌 接种时 动作要轻 以 防气流中夹带细菌进入培养容器造成污染 3 材料的分离 切取和接种 分段外植体接种的具体步骤如下 在无菌条件下切取消过 毒的外植体 较大的材料可肉眼直接观察切离 较小的外植体需要在双筒实体显微镜下操作 切取 材料通常在无菌培养皿或载玻片上进行 将试管或三角瓶瓶口靠近酒精灯火焰 瓶口倾斜 将瓶口 外部在火焰上烧数秒钟 然后轻轻取出封口物 将瓶口在火焰上旋转灼烧后 用灼烧后冷却的镊子 将外植体均匀分布在培养容器内的培养基上 将封口物在火焰口旋转灼烧数秒钟后封住瓶口 接种 完毕后 封口膜上注明接种植物名称 接种日期 处理方法等 以免混淆 4 4 培养条件培养条件 外植体接种后 须置于适宜的条件下进行培养 培养条件包括温度 光照 通气和湿度等 温度 不同植物繁殖的最适温度不同 大多数在 20 30 之间 通常控制在 25 土 2 恒温条件下培 养 温度过低 15 或过高 35 都会抑制细胞 组织的增殖和分化 不利于培养物生长 光照 光照对植物细胞 组织 器官的生长和分化具有很大的影响 光效应主要表现在光照强度 光 照时间和光质等方面 一般培养室要求光照 12 16h d 光照强度 10