HPV病毒的常用通用引物检测

精品文档 1欢迎下载 HPVHPV 病毒的常用通用引物检测病毒的常用通用引物检测 摘要摘要研究表明 HPV 病毒感染与人体多种肿瘤的发生相关 对感染个体 的病毒检测具有重要的疾病诊断 治疗 预防意义 但目前缺乏可以兼顾敏感 性 特异性 操作简单 可以大规模推广使用的可靠检测方法 对待测样本进 行 PCR 检测仍是目前实验室最多采用的检测方法 PCR 具有高敏感 易操作的 优点 但其反应的灵活性和极高的敏感性 也带来了假阳性和假阴性的问题 针对 HPV 病毒 L1 序列保守区域设计的通用引物检测 最常被应用于大样本检测 通用引物可以在一次 PCR 反应中同时检测多种型别的 HPV 病毒感染 与序列特 异 PCR 检测相比 可以大大减少检测的工作量 但其缺点在于 通用引物仅与 某个或少数 HPV 型序列匹配 而对于多数型别 HPV 引物结合区都存在或多或 少的碱基错配 这使得通用引物对不同型别的 HPV 扩增效率不同 因此 使用 通用引物检测 HPV 感染时 对于某些与引物匹配较差的 HPV 型别 其感染情况 往往可能被低估 目前常用的通用引物根据设计原则不同分为三类 1 单一引 物如 GP5 6 2 简并引物如 MY09 11 3 混合引物如 SPF1 2 个型 通用引物都有其各自的优缺点 需要根据特定试验的目的 条件选用合适的通 用引物进行检测 关键词关键词 HPVHPV 病毒 通用引物 单一引物 简并引物 混合引物病毒 通用引物 单一引物 简并引物 混合引物 精品文档 2欢迎下载 HPV 病毒是一种亲上皮细胞的双链 DNA 病毒 其基因组长约 7900bp 目前 约共发现约 200 多型 HPV 病毒 该病毒主要感染皮肤和粘膜的上皮细胞 造成 上皮增生甚至恶性转化 1 2 3 人们已经在生殖道检测到超过 40 型的 HPV 其中许多与宫颈内皮增生及宫颈癌密切相关 如 16 18 31 33 35 等 这 部分 HPV 病毒被称为高危型 4 5 而 HPV6 11 等型别主要存在于良性病变中 多造成生殖道疣等疾病 被称为低危型 6 7 但人为区分的高危型和低危型并 不是绝对的 因为在一些癌变中确实也存在所谓的低危型 HPV 8 多数 HPV 病毒对人体的感染都是一过性的 病毒很快会被人体免疫系统清 除 但少数情况下 病毒整合入宿主基因组 DNA 转变为持续感染 9 这种感 染方式被认为与感染部位的恶性病变相关 10 接近 100 的宫颈癌样本中都可 以检测到 HPV 病毒的存在 11 12 据估计 每年约 290 000 人死于宫颈癌 同 时每年有 490 000 例新发宫颈癌病例 13 因此 对 HPV 病毒有效的检测方法 将具有重要的临床和社会意义 目前 HPV 病毒尚不能人工体外培养 而 HPV 的血清学检测技术也不成熟 因此 对 HPV 感染的检测方法仍然局限于使用分 子生物学的方法在待测样本中直接检测 如 原位杂交 液相杂交 杂交捕获 技术 等 14 15 16 17 18 但是这些方法不但操作复杂 而且敏感性有限 HPV 病毒的 PCR 检测虽然具备操作简单 高敏感性的优点 但污染严重 容易 产生假阳性 因此无法推广到临床应用 目前尚缺乏一种能克服上述所有缺点 同时保持各自优点的成熟检测方式 对于具有严格的污染控制 同时需要高敏感 大样本的检测 HPV 病毒的实 验室 使用 PCR 检测仍是首选方案 但是鉴于 HPV 存在如此多的类型 对每一 型都使用其特异引物进行 PCR 检测将是十分巨大量的工作 同时 序列特异 PCR 只能扩增序列已知的 HPV 对于未知 HPV 型或存在变异的 HPV 则不能有效扩 增检测 因此 人们选取 HPV 基因组序列中较为保守的 L1 和 E1 基因区域设计 通用引物 以实现在单一 PCR 反应中同时检测多种型别 HPV 的目的 19 20 21 本文对目前常用的 HPV 通用引物进行了综述 在各自引物的序列分析基础上 精品文档 3欢迎下载 对其优缺点进行了阐述 一 一 HPVHPV 病毒的病毒的 PCRPCR 通用引物检测通用引物检测 通常 通用引物的设计遵循三条原则 1 上下有引物均为惟一序列 通用 引物只与某一型或少数几型 HPV 扩增序列完全匹配 在多数 HPV 型的引物结合 区域 通用引物均存在或多或少的碱基错配 使用该种类型的通用引物 应当 使用较低的煺火温度 以保证引物可以与存在碱基错配的 HPV 型结合 这种通 用引物的代表为 GP5 6 22 23 2 通用引物由一系列简并引物混合而成 这些引物的某些特定位点随机出现两到三种不同的碱基 通过这种方法来弥补 不同型别 HPV 在这些位点的序列差异 简并引物的代表为 MY09 11 24 3 通 用引物的上下游均由一系列不同的引物混合构成 这些引物充分考虑了各型 HPV 在特定位点的序列差异 在混合引物中 尽量存在与各型 HPV 均达到碱基 完全配对的引物 对于某些多数 HPV 都在此处存在较大的序列差异的位点 这 种通用引物在此位点引入肌苷来替代常规的碱基 这一位点的肌苷虽然不能与 模板序列形成共价配对 但也不致形成空泡 这种通用引物与各型 HPV 碱基配 对都较好 因此可以采用较严格的 PCR 条件 其检测效率和敏感性也较高 代 表引物为 SPF1 2 25 各种类型的通用引物都存在其各自的优缺点 本文将分别代表性的介绍这 三种通用引物 1 GP5 6 GP11 12 及 GP5 6 通用引物 图图 1 1 GP5 6GP5 6 GP11 12GP11 12 引物序列及其与引物序列及其与 9 9 型型 HPVHPV 病毒的匹配情况病毒的匹配情况 精品文档 4欢迎下载 小点表示各型小点表示各型 HPVHPV 序列与引物序列相同 各型序列与引物序列相同 各型 HPVHPV 序列与引物序列的差异用相应碱基字母序列与引物序列的差异用相应碱基字母 标出标出 GP5 6 和 GP11 12 通用引物由 Peter J F Snijders 等于 1990 年发表 其目的是开发一种可以方便 敏感的 HPV 广谱检测方法 26 这两对通用引物都 扩增 HPV L1 基因的一段保守序列 其中 GP5 6 针对感染生殖道的 HPV 类型如 HPV6b 16 18 33 型 GP11 12 针对感染皮肤的 HPV 类型如 1a 5 8 型等 与以往的序列特异引物相比 GP5 6 和 GP11 12 通用引物在大规模检测 HPV 病 毒时具有较显著的优势 它实现了高通量检测 只需通过一次 PCR 反应 就可 以扩增样本中的多种不同类型 HPV 病毒 虽然该引物只与少数几型 HPV 病毒序 列完全匹配 多数型别的 HPV 病毒在引物结合区都存在碱基错配 但作者的研 究证实 当错配在三个以下时 并不会显著影响 PCR 的扩增效率 不可否认 使用该通用引物扩增 HPV 病毒序列存在许多局限性 首先 由于错配序列的存 在 引物与模板的结合势必受到影响 这将大大降低 PCR 扩增的效率 因此 使用这两对通用引物进行 PCR 扩增时 常常需要使用与平常不同的 PCR 反应条 件 作者推荐了 40 度的退火温度及 3 5 到 10 mM 的 Mg 离子浓度 在这种情况 下 尤其是扩增模板的拷贝数较低时 PCR 扩增产物往往会产生许多非特异条 带 影响研究人员对结果的判断 对于包含较多非特异条带的 PCR 产物分析 作者推荐使用 south blot 杂交的方式进行 其次 在作者发表这两对引物时 仅有 9 种类型的 HPV 病毒序列得到测定 现在已知的多数 HPV 病毒类型的序列 仍然处于未知状态 因此 作者设计 GP5 6 和 GP11 12 时可用的 HPV 病毒序列 信息是有限的 不可避免存在较大的改进空间 虽然具有局限性 但这两对通用引物尤其是 GP5 6 及其衍生物仍然是十分 成功的 因为它较早的实现了高通量 HPV 病毒检测 27 图图 2 2 GP5 6 GP5 6 引物序列及其与引物序列及其与 2323 型型 HPVHPV 病毒的匹配情况病毒的匹配情况 精品文档 5欢迎下载 小点表示各型小点表示各型 HPVHPV 序列与引物序列相同 各型序列与引物序列相同 各型 HPVHPV 序列与引物序列的差异用相应碱基字母序列与引物序列的差异用相应碱基字母 标出标出 对通用引物 GP5 6 的序列分析 发现 HPV 病毒序列的引物结合区域向 3 端 延伸仍然存在数个碱基的保守序列 据此 Ana Maria de Roda Husman 等通过 对 GP5 6 通用引物的改进发展了新的通用引物 称为 GP5 6 28 由于引物结 合区域配对碱基序列比 GP5 6 多 GP5 6 具有相对较高的特异度和敏感度 在 对 22 例克隆的 HPV 病毒序列扩增实验中 GP5 6 的敏感度比 GP5 6 高 10 到 100 倍 并且在对 PCR 产物的电泳分析发现 GP5 6 产物的特异度好 杂带少 GP5 6 通用引物的检测敏感性仍然与引物结合区域的碱基匹配程度相关 当 GP5 6 引物与模板匹配较好时 可以检测到飞克 femtogram 水平的病毒序 列 而当其中一个引物或引物对与模板存在 4 个或更多碱基错配时 只可以检 测到皮克 picogram 水平 将 GP5 引物向 3 端延伸三个碱基 有 TAC 或 CAC 两种选择 如图 2 所示 研究发现 当选择 CAC 序列时 引物内部容易形成六个碱基的互补结构 这样 的结构会促使引物二聚体的形成 反而使检测敏感性下降 选择 TAC 序列则不 会出现此情况 与此相同 GP6 引物向 3 端延申有两种选择 5 TACTC 3 或 5 TATTC 3 根据同样原因而选择了 5 TACTC 3 序列 虽然 GP6 引物的 3 端仍然存在 3 个碱基的保守序列 但研究者并没有继续向外延伸 因为那样将 会使两条引物的 Tm 值相差过大 并且 引物过长 必然需要提高 PCR 反应的煺 火温度 这也不利于与引物存在较多剪辑错配的 HPV 型的检测 虽然比起 GP5 6 来说 GP5 6 引物在多数 HPV 型中都引入了一个或更多的碱基错配 但 是这对引物总体上提高了引物与模板的结合能力 使用这对引物进行 PCR 反应 可以获得更好的特异性和敏感性 研究人员对 GP 引物的改进 并没有局限在序列的优化方面 Mark F Evans 等发展了递减 PCR Touchdown PCR 的方法来获得更敏感及更特异的 PCR 扩 精品文档 6欢迎下载 增 29 递减 PCR 通过在 PCR 的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性 循环设在比估算的 Tm 高大约 5 的退火温度下开始 然后每个循环降低 1 到 2 直到退火温度低于 Tm 5 因此 在反应的前几个循环 特异性最高的目 的片段会被优先扩增 这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势 这样就允 许后续循环中使用较低的煺火温度而不至于影响反应的特异性 递减 PCR 可以很好的扩增模板很少的样本以及与通用引物序列结合区域存 在较多错配的 HPV 类型 在作者发表的论文中 使用 Touchdown PCR 检测宫颈 癌样本比经典的 GP5 6 PCR 条件发现了更高的阳性率和更多的感染型别 另 外 经典的 GP5 6 PCR 条件检测 26 例乳腺癌样本的阳性率为 19 而使用 Touchdown PCR 检测的阳性率为 58 通过对宫颈脱落细胞样本检测研究表明 使用 GP5 6 进行 PCR 后 产物 凝胶电泳分析时的敏感性比 GP5 6 提高 11 如果使用混合探针对 PCR 产物进 行杂交分析 敏感性提高 4 但是 在 GP5 6 阳性而 GP5 6 阴性的样本中 不包括六种在宫颈中常见的 HPV 类型 这是因为这些 HPV 型的引物区序列本生 就与引物匹配性很好 引物的修改没有显著的增加其扩增效率 GP5 6 虽然具 有较高的扩增效率 也仍然存在一些缺陷 如对 HPV52 一种常见的宫颈高危 HPV 扩增效率不高 30 但作为一种成功的通用引物 GP5 6 对于大规模人群 筛查 及多种类型 HPV 感染 HPV 多重感染样本的检测具有意义 31 图图 3 3 GP5 6 GP5 6 的普通的普通 PCRPCR 条件和条件和 TouchdownTouchdown PCRPCR 反应条件比较反应条件比较 精品文档 7欢迎下载 2 MY09 11 HMB01 及 PGMY09 11 通用引物 图图 4 4 MY09 11 HMB01MY09 11 HMB01 引物序列及其与引物序列及其与 1818 型型 HPVHPV 病毒的匹配情况病毒的匹配情况 小点表示各型小点表示各型 HPVHPV 序列与引物序列相同 各型序列与引物序列相同 各型 HPVHPV 序列与引物序列的差异用相应碱基字母序列与引物序列的差异用相应碱基字母 标出标出 简并碱基表示如下 简并碱基表示如下 M M A A 或或 C C W W A A 或或 T T Y Y C C 或或 T T R R A A 或或 G G MY09 MY11 由 Manos 等于 1990 年最早发表 24 当时 仅有 HPV6 11 16 18 33 五种病毒序列被研究人员完全掌握 所以基于这五种 HPV 病毒序列 人们选择了 L1 基因的一段保守序列设计通用引物 并希望该引 物可以通过一次 PCR 过程同时扩增出这五型 HPV 病毒 为了推广应用该引物 研究人员假定其他序列没有完全知道的 HPV 病毒基因序列在这一段也是保守的 同样适用于该引物扩增 事实上 MY09 MY11 引物只与 HPV6 型的引物结合区域 序列完全匹配 其它几型都存在在一些碱基位点的序列差异 为了使引物能够 更好的与存在序列差异的结合区煺火 该引物的设计者采用了简并碱基的方式 因此 MY09 MY11 是由 24 条序列存在差异的不同引物混合而成的 事实证明 MY09 MY11 是十分成功的通用引物 32 33 它可以有效扩增超过 30 型的生殖 道 HPV 病毒 MY09 MY11 扩增约 450bp 长的片段 可以为研究人员提供较多的 病毒序列信息 34 35 36 精品文档 8欢迎下载 但是作为简并引物 MY09 MY11 的缺点也很明显的 简并引物的合成需要 在引物序列的特定位点随机插入两到三种不同的碱基 这一过程是不可控制的 导致人们无法保证在混合引物中每一种特定的引物序列都能够以相同的几率出 现 因此 不同批次合成的 MY09 MY11 实际存在差异 而这种差异往往导致不 同批次合成的引物对相同样本中病毒的扩增也会出现效率不同的问题 这种缺 点对于需要扩增条件稳定 试验结果均一 的大样本病毒感染率检测是十分不 利的 图图 5 5 PGMY09 11PGMY09 11 引物组成引物组成 PGMY09PGMY09 I I 和和 PGMY09PGMY09 P P 5 5 端删除两个碱基 避免引物出现内部发卡结构 影响端删除两个碱基 避免引物出现内部发卡结构 影响 PCRPCR 扩增 扩增 HMB01HMB01 设计针对设计针对 HPV51HPV51 型 此型病毒为高危型 并且型 此型病毒为高危型 并且 PGMYPGMY 引物不能有效扩增 引物不能有效扩增 P E GRAVITT 等针对 MY09 11 的缺点进行了改进 于 2000 年发表了 PGMY09 11 通用引物 37 PGMY 通用引物的引物结合区域与 MY09 11 相同 但该 引物不使用简并引物 而使用了与 SPF1 2 相似的混合引物 研究人员通过序列 分析 将已知的 HPV 病毒序列根据 MY09 11 引物结合区域相似性分组 再根据 每组的序列匹配性 设计了由 5 条序列组成的 PGMY11 及由 13 条序列组成的 PGMY09 PGMY09 11 避免了使用简并引物 混合引物中每条引物都是单独合成 并以相同的比例掺入到混合引物池中 PGMY09 11 通用引物保证了每条引物都 能以固定比例存在 从而确保了不同批次合成引物的均一性 在一项研究中 科研人员使用 MY09 11 和 PGMY09 11 分别检测了 262 例宫 精品文档 9欢迎下载 颈脱落细胞样本 38 结果发现 PGMY09 11 的阳性样本比 MY09 11 多 20 例 62 8 55 1 同时 PGMY09 11 的多重感染检测率也比 MY09 11 高 40 0 33 8 HPV 26 35 42 45 52 54 55 59 66 73 和 MM7 型使用 PGMY09 11 的检测率比 MY09 11 高 25 所以 PGMY09 11 引物提供了一 种比 MY09 11 更加敏感 特异的检测方法 39 40 41 42 3 SPF1 2 通用引物 图图 6 6 SPF1 2SPF1 2 引物及探针组成引物及探针组成 i i 代表次黄嘌呤核苷 代表次黄嘌呤核苷 inosineinosine 图图 7 7 SPF1 2SPF1 2 引物结合区域引物结合区域 3838 型型 HPVHPV 病毒的碱基位点差异病毒的碱基位点差异 以以 HPV16HPV16 型为代表 小点表示各型型为代表 小点表示各型 HPVHPV 序列与其序列相同 各型序列与其序列相同 各型 HPVHPV 序列与序列与 HPV16HPV16 型序列的差异用相应碱基字母标出型序列的差异用相应碱基字母标出 精品文档 10欢迎下载 由于现存的通用引敏感性较低 包括的 HPV 类型局限等问题 Bernhard Kleter 等于 1998 年发表了 SPF1 2 通用引物 25 希望开发一种敏感性高 检 测类型广谱的通用引物 SPF1 2 同样扩增 L1 基因的一段保守序列 其上游引 物位于 GP5 引物的结合区域内 下游引物位于 MY09 引物的结合区域内 该引 物对仅扩增一段 65bp 长的核酸片段 产物需要使用混合探针杂交系统来分辨 43 SPF1 2 通用引物采用了混合引物池的方法 其中 SPF1 由四条引物构成 SPF2 由两条混合引物构成 见图 6 同一引物池中的引物序列仅有个别碱基的 差别 而这些差别正好对应了不同类型 HPV 在该位点的差异 见图 7 SPF 通 用引物可以高效的扩增多达 43 型的 HPV 病毒 并且 与 GP5 6 及 MY11 09 相 比 具有如下优势 1 SPF1 2 的扩增片段只有 65bp 而 GP5 6 及 MY11 09 的扩增片段分别为 150 bp 和 450 bp 而 PCR 的特性导致较短的片段往往具有 较高的扩增效率 44 45 2 PCR 的效果与实验样品 DNA 的质量息息相关 一 些样本如石蜡提取样本的 DNA 质量往往较差 此时 扩增短片段的 SPF1 2 就具 有比扩增较长片段的 GP5 6 及 MY11 09 具有更大优势 46 3 SPF1 2 是混合 引物 比 GP5 6 及 MY11 09 与扩增模板的匹配性更好 错配更少 并且 SPF1 2 引物的 3 端与大多数型别 HPV 都高度匹配 因此具有更高的扩增效率 47 48 4 SPF1 2 不但可以高效扩增感染生殖道的 HPV 型 还可以扩增皮肤 型的 HPV 病毒如 3 4 5 8 27 32 37 65 71 等 图图 8 8 MY09 11 MY09 11 GP5GP5 6 6 和和 SPF1 2SPF1 2 在在 L1L1 基因的位置及扩增片段基因的位置及扩增片段 二 结语 二 结语 由于 MY09 MY11 HMB01 GP5 GP6 和 SPF1 SPF2 三种针对 HPV 病毒 L1 基因序列的通用引物可以有效的扩增现在已知的大部分 HPV 病毒 尤其是感染 生殖道的 HPV 病毒类型 同时 这些通用引物还可以发现新的病毒型 亚型 精品文档 11欢迎下载 及病毒变异体 因此 这三对通用引物被广泛应用于大样本流行病调查中 图 8 表示了本文叙述的三种通用引物在 L1 基因的位置及扩增片段长短 49 由图 可知 SPF1 与 MY11 序列重叠 GP5 与 SPF2 序列重叠 不同类型通用引物扩增 效率 优势型别不同 50 在实验时 根据试验目的选用合适的通用引物就显得 非常重要 SPF1 2 扩增短片段 效率最高 适用于各种不同的检测模板 尤其 是 DNA 模板片段较短时 SPF1 2 仍能很好的检测 但其产物只能通过探针杂交 检测 同时它提供的病毒序列信息也十分有限 MY11 09 扩增 450bp 长短的序 列 可以提供较多的病毒序列信息 但该引物对模板质量要求较高 如石蜡提 取样本就不适合使用该引物检测 GP5 6 扩增片段长度中等 是目前最为常用 的通用引物 不同的通用引物 PCR 扩增效率不同 51 而且 当同一个样本中同时存在 多种 HPV 类型感染时 通用引物扩增往往存在竞争抑制 这时 多重感染就很 难正确检测 52 特别是存在较多碱基错配的 HPV 及感染量很低的样本 就很 难被检测到 针对通用引物的这些缺点 研究人员尝试了许多解决方案 如 将 SPF1 和 GP6 配合使用 改造 GP5 6 单一引物 使其成为类似 SPF1 2 的混 合引物 结合 PCR 限制性酶切长度多态分析 探针杂交 53 等 合理选用通用引物 灵活掌握使用方式 勇敢尝试变通 严格的质量控制 这些都是通用引物检测 HPV 病毒感染的成功关键 54 55 精品文档 12欢迎下载 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