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方法与材料范文方法与材料范文 异丙酚下调脂多糖诱发的大鼠肺泡 型上皮细胞4TLR4的表达马铃洪 涛陈卫民 中国医科大学附属盛京医院麻醉科 沈阳 110004 摘要 目的探讨不同浓度异丙酚对脂多糖诱发的大鼠肺泡II型上皮 细胞 AT 免疫作用机理 方法原代培养大鼠AT 细胞 随机分为五组C组对照组 不添加任何 药物 培养3小时 LPS组1 g ml 1LPS培养3小时 P1组1 ml 1LPS和25 M异丙酚培养3小时 P2组1 g ml 1LPS和50 M异丙酚培养3小时 P3组1 g ml 1LPS和100 M异丙酚培养3小时 测定AT 细胞TLR4mRNA和蛋白含量 培养基上清中TNF 含量 结果1 g ml 1LPS增加AT 细胞TLR4mRNA和蛋白的表达 增加TNF 含量 P 0 05 50 M和100 M异丙酚能下调LPS引起的AT 细胞TLR4mRNA和蛋白表 达的增加 抑制LPS引起TNF 含量的增高 P 0 05 结论异丙酚可能通过剂量依赖性的抑制LPS引起的ATII细胞的TLR4mR NA和蛋白表达 减少TNF 含量从而减少肺组织炎症反应 关键词 肺泡II型上皮细胞 二异丙酚 Toll样受体 肿瘤坏死 因子 第一马铃 博士在读 工作单位中国医科大学附属盛京医院 通信作者陈卫民 沈阳市和平区三好街36号 电话024 83955042 Email chenwm sj hospital正文字数2946字图数6Propofol downregulatesLPS induced TLR4expression inrat alveolar type II epithelial cellsMa Ling et al Department ofAnesthesiology Shengjing Hospitalof ChinaMedical University Shenyang 110004 China Abstract Objective Toinvestigate whetherLPS inducedinflammation inATII isthrough TLR4and theeffect ofdifferent dosageof propofolon theinflammation Methods Theprimarily culturedATII cellswere randomlyassigned toone ofthe followingfive groups Group C AT IIcells inuntreated group control was culturedfor3h Group LPS treated with1 g ml 1LPS for3h Group P1 treated with1 ml 1LPS and25 M propofolfor3h Group P2 treated with1 g ml 1LPS and50 M propofolfor3h Group P3 treated with1 g ml 1LPS and100 M propofolfor3h Real timePCR wasused todetect TLR4mRNA expressionwhile westernblot wereused tomeasure therelative TLR4protein expression TNF levels insupernatant weremeasured usingELISA Results1 g ml 1LPS significantlyincreased TLR4mRNA andprotein expression as wellas TNF levels inAT IIcells P 0 05 Propofol at50and100 M significantlyinhibited theincrease inTLR4mRNA andprotein expression and TNF levels induced by LPS P 0 05 Conclusion Propofolcan dose dependently inhibitinflammatory effectinducedbyLPS inAT IIcell perhaps throughits downregulationof TLR4gene andprotein expression Key words alveolar typeIIepithelialcell propofol Toll like receptor tumor necrosisfactor 肺泡 型上皮细胞 AT 合成和分泌表面活性物质 控制着肺 泡腔内液体的量和构成 并且可以在肺损伤后增殖和分化成肺泡 型上皮来维持肺泡组织的完整性 1 2 最近研究显示AT 细胞在肺泡炎性反应发展的调控中起作用 AT 细胞可在体外炎性刺激下分泌趋化因子 提示它在急性肺损伤 中存在病理作用 脂多糖 LPS 可上调Toll样受体4 TLR4 的表达 内毒素的炎性反应主要由TLR4调节 TLR4的激活导致了炎症级联瀑布效应 包括促炎性反应调节因子TNF 的表达 3 4 5 迄今尚未有关于异丙酚对LPS刺激的ATII细胞炎性反应通路影响的报 道 本项目将探讨不同浓度异丙酚对肺损伤的靶细胞AT 细胞免疫学作 用机理 材料与方法主要材料Percoll液 北京拜尔迪公司 BCIP NBT染色 剂 Sigma公司 美国 中性红溶液 Sigma公司 美国 异丙酚 As traZeneca公司 意大利 LPS E Coli O55 B5 Sigma公司 美国 TRIzol Invitrogen公司 美国 SYBR PrimeScriptTM实时定量PCR试剂盒 DRR063S TaKaRa公司 全蛋 白提取试剂盒 凯基公司 EasyQuant蛋白分析试剂盒 北京全式 金公司 羊抗大鼠TLR4多克隆抗体 sc 16240Santa Cruz公司 美国 小鼠抗大鼠 actin单克隆抗体 sc 47778Santa Cruz公司 美国 二抗IgG Pierce公司 美国 化学发光试剂盒 EasyECL TNF ELISA试剂盒 R下游GAAACTGCCATGTCTGAGCA 大鼠GAP DH 上游ATGTTCCAGTATGACTCCACTCACG 下游GAAGACACCAGTAGACTCCACG ACA 每个样本做三个平行管 每个样本的管家基因GAPDH的mRNA表达与TLR 4mRNA同时测量 SDS1 3软件分析结果 TLR4蛋白水平的测定使用凯基全蛋白提取试剂盒提取总蛋白 EasyQ uant试剂盒测定蛋白浓度 PBS稀释至相同浓度 沸水中加热5min后取20 g蛋白上样 10 SDS PAGE电泳分离后 转至纤维素膜 浸入封闭液室温过夜 1200羊抗大鼠TLR4一抗孵育2小时 actin作为内参 Tris缓冲盐冲洗膜5min 3次 12000辣根过氧化物酶标记二抗IgG在室温下孵育1小时 Tris缓冲盐 洗膜5min 3次 化学发光法显色 Scion软件分析膜上目的条带的密度值 TLR4的免疫荧光检测ATII细胞爬片至18 18mm的玻璃载玻片上 随 机分成各组 3小时后4 的多聚甲醛固定15分钟 PBS洗3次 室温下 用5 BSA封闭细胞15分钟 用1 160TLR4多克隆抗体稀释液4 孵育过夜 PBS洗3次 1200FITC 结合兔抗羊IgG孵育2小时 缓冲甘油风片 激光共焦显微镜下 Leica TCSSp2AOBS 德国 观察成像 ELISA测定培养基上清TNF 取细胞培养上清 70 保存 大鼠TNF ELISA试剂盒测定TNF 水平 统计学处理应用SPSS13 0统计软件进行统计学分析 计量资料以均 数 标准差 x s 表示 组间差异采用单因素方差分析 P 0 05 为差异有统计学意义 结果ATII细胞的鉴定AKP染色蓝染细胞为ATII细胞 红染细胞为巨噬 细胞 中性粒细胞等 图1A 透射电镜显示了ATII细胞的标准板层小体 图1B ATII细胞纯度为85 5 图1AKP染色蓝染的ATII 左 标尺为50 m 透射电镜显示ATII细 胞 胞浆内典型板层小体 右 放大倍数为4000倍 各组ATII细胞TLR4mRNA的表达1 g ml的LPS可以明显增加ATII细胞T LR4mRNA表达 P 0 018 与LPS组对照 P2组 P 0 017 和P3组 P 0 003 的TLR4mRNA表达 明显被抑制 提示50 M和100 M的异丙酚可以剂量依赖性的抑制LP S引起的ATII细胞的TLR4mRNA表达 图2 图2TLR4mRNA的相对表达 与C组比较 P 0 05 与LPS组比较 P 0 05各组ATII细胞TLR4蛋白表 达LPS刺激3小时后 TLR4蛋白表达明显增加 P 0 002 与LPS组比较 P2组 P 0 031 和P3组 P 0 010 的TLR4蛋白表达 明显下降 见图3 图3 ATII细胞的TLR4蛋白表达 与C组比较 P 0 05 与LPS组比较 P 0 05TLR4在ATII细胞上的表达 首先使用相差显微镜确认TLR4在细胞表面的表达 图4 共焦显微镜进一步研究了LPS和异丙酚对TLR4表达的影响 如图5所示 经LPS 1 g ml 处理的ATII细胞TLR4表达增加 使用25 M 50 M和100 M的异丙酚处理后 ATII细胞TLR4的表达剂 量依赖性降低 图 4 相差显微照片显示了AT II细胞 图4A 免疫荧光显微照片中TLR4表达 图4B 培养基中的大多数细胞外膜因含有TLR4蛋白抗体而被着色 图4C 图5免疫荧光照片 标尺 37 5 m 异丙酚对ATII细胞TNF 含量的影响对照组TNF 水平为271 35pg ml 1 g ml LPS提高TNF 水平至600 222pg ml P 0 003 25 M 50 M和100 M异丙酚分别使ATII细胞的TNF 水平降低至374 197pg ml 325 79pg ml和232 44pg ml 与LPS 组相比 P值分别为0 067 0 017和0 001 图6 图6 ELISA法测定TNF 的浓度 与C组比较 P 0 05 与LPS组比较 P 0 05讨论本研究显示50 M和1 00 M的异丙酚可以减少LPS诱导的原代培养大鼠ATII细胞的TLR4mRN A表达和蛋白表达 并且可以减少细胞TNF 表达水平 ATII细胞被认为是肺泡上皮的干细胞 ATII的功能多样能增殖成新的ATII 还可以分化为其他上皮细胞如 肺泡I型上皮细胞 合成和分泌表面活性物质 参与肺损伤修复 肺 水转运功能 强大的免疫功能 ATII与多种生理及病理情况下肺的呼吸功能和非呼吸功能密切相关 近年来对ATII的研究颇为活跃 ATII作为气道炎性反应的直接靶细胞 在气道炎性反应的激发和恶 化 及动员效应细胞 巨噬细胞 中性粒细胞 表达和产生炎性介 质中起到重要作用 TLR在天然免疫防御中起重要作用 并最终激活获得性免疫系统 TLR4属于病原体识别相关受体 它通过依赖髓样分化蛋白88 MyD88 或非依赖MyD88信号转导途径激活NF B 进而诱导TNF IL 1 环氧合酶 2 细胞内黏附分子 1 胶原酶等多种细胞因子 化学因子的生成与释放 引发炎症反应 有研究显示LPS介导的宿主反应完全依赖于TLR4 本研究提示1 g ml LPS处理ATII细胞3小时后可引发明显的TLR4上调和TNF 水平增高 异丙酚作为常用的静脉麻醉药物 能有效的预防肺损伤 Kwak SH等 7 报道异丙酚能减少内毒素引起的肺水肿 促炎性细胞因子 I L 8 和中性粒细胞反应以及组织学改变 胡晓敏等 8 在肠缺血再灌注后肺损伤大鼠的研究提示异丙酚可减轻 其肺损伤程度 可能与异丙酚的抗氧化功能有关 而其具体作用机制仍待进一步研究 Jawan B等人 9 在大鼠肝细胞系的研究显示100 M异丙酚预处理24小时能 明显抑制TLR4 CD14 TNF 等基因的表达 提示其减轻败血症相关性肝脏炎性反应的机制与 抑制TLR4和CD14表达有关 本研究证明异丙酚可以剂量依赖性的抑制LPS引起ATII细胞的TLR4mR NA及蛋白表达 减少TNF 水平 50 M和100 M的异丙酚作用有统计学意义 本研究进一步在细胞水平证实异丙酚能有效的预防肺损伤 并探讨 了其预防机制与下调TLR4表达有关 异丙酚维持麻醉时的药物浓度大约为17 22 M 10 而在麻醉诱导单次给药后血药浓度可达56 M 11 本研究采用 25 50和100 M异丙酚反映了临床相关剂量 提示临床相关剂量的异丙酚即可通过下调TLR4基因和蛋白的表达 降低TNF 水平部分抑制LPS处理的ATII细胞的炎性反应 从而到达减轻细胞 水平肺损伤的作用 参考文献1 Evans MJ Cabral LJ Stephens RJ Freeman G Transformation ofalveolartype2cells totype1cells followingexposure toNO2 Exp MolPathol 1975 22 142 50 2 Crandall ED Matthay MA Alveolar epithelialtransport Basic scienceto clinicalmedicine Am JRespir CritCare Med xx 163 1021 9 3 Togbe D Schnyder Candrian S Schnyder B et al TLR4gene dosagecontributes toendotoxin induced acuterespiratory inflammation J LeukocBio xx 80 451 457 4 Jeyaseelan S Chu HW Young SK et al Distinct rolesof patternrecognition receptorsCD14and Toll like receptor4in acutelung injury Infect Immun xx 73 1754 63 5 Smith LS Kajikawa O Elson G et al Effect ofToll likereceptor4blockade onpulmonary inflammationcaused bymechanical ventilationand bacterialendotoxin Exp LungRes xx 34 225 43 6 Richards RJ Davies N Atkins J Oreffo VI Isolation Biochemical Characterization and Cultureof LungType IICells ofthe Rat Lung 1987 165 143 158 7 Kwak SH Choi JI Par