三种荧光定量PCR检测方法比较

三种荧光定量 PCR 检测方法比较 定量 pcr 以参照物为标准 对 PCR 终产物进行分析或对 PCR 过程进行监测 从而 达到评估样本中靶基因的拷贝数 称为定量 PCR 定量 PCR 的可行性定量一般是在 PCR 扩增的指数期进行的 常见荧光定量 PCR 检测方法可分为以下几类 1 SYBR Green I 检测模式 SYBR Green I 是一种能与双链 DNA 结合发光的荧光染料 其与双链 DNA 结合后 荧光大大增强 因此 SYBR Green I 的荧光信号强度与双链 DNA 的数量相关 可以 根据荧光信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量 SYBR Green I 的最大吸收波长 约为 497nm 发射波长最大约为 520nm PCR 扩增程序一般为 94 55 72 三 步法 40 个循环 SYBR Green I 的缺点 由于 SYBR Green I 没有特异性 不能识别 特定的双链 只要是双链就会结合发光 对 PCR 反应中的非特异性扩增或引物二聚体也 会产生荧光 通常本底较高 所以在临床上使用可能会有假阳性发生 SYBR Green I 的优点 SYBR Green I 的优点是因为其缺点产生 由于它能所有的 双链 DNA 相结合 所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针 通用性较好 并且 价格相对较低 这对科研是很有利的 因此国内外在科研中使用比较普遍 2 水解探针模式 taqman 探针 TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针 荧光基团连接在探针的 5 末端 而淬灭剂则在 3 末端 当探针与靶序列配对时 荧光基团发射的荧光因与 3 端的淬灭剂接近而被淬灭 在进行延伸反应时 聚合酶的 5 外切酶活性将探针切断 使得荧光基团与淬灭剂分离 发 射荧光 一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生 随着扩增循环数的增加 释放出来的荧光基团不断积累 因此 Taqman 探针检测的是积累荧光 PCR 扩增程序通 常是 94 60 40 个循环 常用的荧光基团是 FAM TET VIC HEX 3 杂交探针模式 Beacon FRET 分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针 两端的核酸序列互补配对 因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近 荧光基团被激发后产生 的光子被淬灭剂淬灭 由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来 分子信 标的茎环结构中 环一般为 15 30 个核苷酸长 并与目标序列互补 茎一般 5 7 个核苷酸 长 并相互配对形成茎的结构 荧光基团标记在探针的一端 而淬灭剂则标记在另一端 在复性温度下 因为模板不存在时形成茎环结构 当加热变性会互补配对的茎环双链解开 如果有模板存在环序列将与模板配对 与模板配对后 分子信标将成链状而非发夹状 使 得荧光基团与淬灭剂分开 当荧光基团被激发时 因淬灭作用被解除 发出激发光子 由 于是酶切作用的存在 分子信标也是积累荧光 常用的荧光基团 FAM Texas Red PCR 扩增程序通常是 94 55 72 三步法 40 个循环 FRET 探针又称双杂交探针 FRET 探针由两条相邻探针组成 在一条探针的 5 端 标记 FAM 荧光基团 另一探针的 3 端标记 Red 640 荧光基团 当复性时 探针结合在 模板上 FAM 基团和 Red640 基团相邻 激发 FAM 产生的荧光 作为 Red640 基团 的激发光被吸收 使 Red640 发出波长为 640 的荧光 当变性时 探针游离 两基团距 离远 不能产生 640 波长的荧光 由于 FRET 探针是靠近发光 所以检测信号是实时信 号 非累积信号 常用的荧光基团是 LC Red640 LC Red705 能用于实时荧光 PCR 定量的方法很多 各有优缺点 应根据实验的需要和当前的实 验条件选择适合自己的方法 下面为各种方法的比较 实验中的一些好习惯 加入试剂之前 把它混匀一下 以免放置时间长了浓度不均 移液枪用完之后要归到 最大计量的位置 防止久而久之弹簧失去弹性 一定要记着关水浴箱 切记切记 多和大家讨论 同时多关注别人讨论的经验 这几 乎是最快提高的捷径了 所有的试剂都自己配 出了问题才好找原因 防止防止 RNA 酶酶污染的措施 污染的措施 1 所有的玻璃器皿均应在使用前于 180 的高温下干烤 6h 或更长时间 2 塑料器皿可用 0 1 DEPC 水浸泡或用氯仿冲洗 注意 有机玻璃器具因可被氯仿 腐蚀 故不能使用 3 有机玻璃的电泳槽等 可先用去污剂洗涤 双蒸水冲洗 乙醇干燥 再浸泡在 3 H2O2 室温 10min 然后用 0 1 DEPC 水冲洗 晾干 4 配制的溶液应尽可能的用 0 1 DEPC 在 37 处理 12h 以上 然后用高压灭菌 除去残留的 DEPC 不能高压灭菌的试剂 应当用 DEPC 处理过的无菌双蒸水配制 然后 经 0 22 m 滤膜过滤除菌 5 操作人员戴一次性口罩 帽子 手套 实验过程中手套要勤换 6 设置 RNA 操作专用实验室 所有器械等应为专用 常用的常用的 RNA 酶酶抑制剂抑制剂 1 焦磷酸二乙酯 DEPC 是一种强烈但不彻底的 RNA 酶抑制剂 它通过和 RNA 酶 的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性 从而抑制酶的活性 2 异硫氰酸胍 目前被认为是最有效的 RNA 酶抑制剂 它在裂解组织的同时也使 RNA 酶失活 它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来 又对 RNA 酶有强烈的变 性作用 3 氧钒核糖核苷复合物 由氧化钒离子和核苷形成的复合物 它和 RNA 酶结合形成 过渡态类物质 几乎能完全抑制 RNA 酶的活性 4 RNA 酶的蛋白抑制剂 RNasin 从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白 RNasin 是 RNA 酶的一种非竞争性抑制剂 可以和多种 RNA 酶结合 使其失活 5 其它 SDS 尿素 硅藻土等对 RNA 酶也有一定抑制作用 因为 DEPC 不加选择的修饰蛋白质和 RNA 因此在分离和纯化 RNA 过程中不能使用 而且它与一些缓冲液 例如 Tri 不能相容 在所有 RNA 实验中 最关键的因素是分离得到全长的 RNA 而实验失败的主要原因 是核糖核酸酶 RNA 酶 的污染 RNA 酶可耐受多种处理而不被灭活 如煮沸 高压灭菌等 研究人员造成的污染 RNA 酶最主要的潜在污染源是研究人员的手 因此进行 RNA 实 验时应勤换手套 但 DEPC 能与胺和巯基反应 因而含 Tris 和 DTT 的试剂不能用 DEPC 处理 动植物总动植物总 RNA 提取提取 Trizol 法 法 Trizol 法适用于人类 动物 植物 微生物的组织或培养细菌 样品量从几十毫克至 几克 用 Trizol 法提取的总 RNA 绝无蛋白和 DNA 污染 RNA 可直接用于 Northern 斑点 分析 斑点杂交 Poly A 分离 体外翻译 RNase 封阻分析和分子克隆 1 将组织在液 N 中磨成粉末后 再以 50 100mg 组织加入 1ml Trizol 液研磨 注意 样品总体积不能超过所用 Trizol 体积的 10 2 研磨液室温放置 5 分钟 然后以每 1mlTrizol 液加入 0 2ml 的比例加入氯仿 盖紧 离心管 用手剧烈摇荡离心管 15 秒 3 取上层水相于一新的离心管 按每 ml Trizol 液加 0 5ml 异丙醇的比例加入异丙醇 室温放置 10 分钟 12000g 离心 10 分钟 4 弃去上清液 按每 ml Trizol 液加入至少 1ml 的比例加入 75 乙醇 涡旋混匀 4 下 7500g 离心 5 分钟 5 小心弃去上清液 然后室温或真空干燥 5 10 分钟 注意不要干燥过分 否则会降 低 RNA 的溶解度 然后将 RNA 溶于水中 必要时可 55 60 水溶 10 分钟 RNA 可进 行 mRNA 分离 或贮存于 70 乙醇并保存于 70 注意 1 整个操作要带口罩及一次性手套 并尽可能在低温下操作 另外 提取上清这步一定要小心 靠近沉淀的部分一定要舍得不要 要不然会有蛋白 质污染 影响比值 2 加氯仿前的匀浆液可在 70 保存一个月以上 RNA 沉淀在 70 乙醇中可在 4 保 存一周 20 保存一年 总总 mRNA 的提取经验 的提取经验 一 关于 Trizol Reagent 需要的试剂 1 Chloroform 氯仿 分析纯 2 Isoproplyl alcohol 异丙醇 分析纯 3 75 Ethanol in DEPC treated water 75 乙醇 要求用分析纯无水乙醇并用 0 01 的 DEPC 处理过的无 Rnase 的水稀释 4 RNase free water 无 Rnase 的水 方法是 将 DEPC 按 0 01 V V 加在 d H2O 中 500ml 50ul 在 37 过夜 并高压灭菌即得 150 3 小时 5 一次性塑料手套 6 注意 DEPC 有致癌之嫌 二 二 关于关于 Trizol Reagent 的使用过程 的使用过程 1 Homogenization 匀浆 a Tissues 组织 每 100mg 组织匀浆加 1mlTrizol 试剂 样品体积不能超过 Trizol 试剂的 10 b Cells Grown in monolayer 单层细胞接毒后出现病变的 针对 JEV 细胞总 RNA 的抽提法 BHK21 细胞长成单层后 接毒 0 5 1ml 采用大瓶 37 吸附 1h 倒掉 加维持液 含 2 的血清和 HEPE8 的 MEM 约 5ml 维持天 出 现 75 100 的病变时 以 PBS 预冷 冲洗细胞两次 直接在细胞瓶中加入 Trizol 试剂 1ml 10cm2 吹吸几次 以裂 解细胞 细胞瓶有两 种常用规格 大的约 45cm2 小的约 30cm2 故所用 Trizol 试剂分别 约为 4 5ml 和 3ml Trizol 试剂的加入是依细胞瓶而定 以盖满瓶 底为度 而不是依据细 胞的数量 否则可导致 DNA 的污染 具体方法如下 样品一定要新鲜 1 组织接入预冷的 EP 管中 加入 Trizol 试剂 1ml 10cm2 量一定要加足 否则易污 染 混匀 吹吸几次 以破裂细胞 置室温 5min 以使核蛋白复合物彻底分离 2 加氯仿 0 2ml 每 1ml Trizol 试剂加入氯仿 0 2ml 盖好 剧烈震荡 15s 置室温 2 3 分钟 3 4 离心 10000g 15min 离心后 混合物将分离为底层为浅红的 中层为酚 氯 仿相 上层为无色的水相 RNA 包含在水相中 水相的体积约相当于所加的 Trizol 试剂量 的 60 4 仔细吸取上层水相 移至另一 EP 管中 5 加 0 5ml 异丙醇 以沉淀 RNA 每 1ml Trizol 试剂加入 0 5ml 异丙醇 置室温 10min 6 4 离心 10000g 10min RNA 沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁 7 弃上清液 加入预冷的 75 乙醇 1ml 每 1ml Trizol 试剂加入 75 乙醇至少 1ml 震荡 充分洗涤沉淀 4 离心 5500g 5min 弃上清液 空气干燥 或真空干燥 后 沉 淀重悬于无 Rnase dH2O 中 吹吸几次 55 60 作用 10 分钟以溶解 RNA 70 保存 备用 8 抽提出的细胞总 RNA 干燥后加水 50ul 取 10ul 加无 Rnase 水 990ul 稀释 100 倍成 1ml 于 0 5cm 厚的石英比色杯中 以无 Rnase 水为对照 在 721 型紫外分光光度 计下检测 结果应为 A260 280 ratio 1 6 9 分离组织 10mg 纯组织 加 800ul Trizol 试剂 10 扩增产物的鉴定 DEPC 处理方法如下 1 DEPC 处理 1 DEPC 水 100ml 超纯水加入 0 2ml DEPC 充分混匀 高压灭菌 2 Tip 头 枪头 EP 管等在提 RNA 过程中及做 RT 时接触 RNA 的器材 包括 1ml 200 l 20 l Tip 头 EP 管和 PCR 反应管等 用 0 1 的 DEPC 水 1000 ml 超纯水 加入 1ml DEPC 37 浸泡过夜 高压灭菌 2 提取 RNA 用 DEPC 水溶解 3 RT 我是用 PCR 仪来控制温度和时间的 所以 RT 是在 PCR 反应管中作的 4 操作过程中要戴一次性手套 并经常换手套 最好把要直接接触样品的东西都用 DEPC 水处理一下 枪头盒插好枪头后 加入 1 2ml 的 0 1 DEPC 水 在灭菌就行了 现在有进口的 RNASE FREE 的枪头买 直接用不 用处理的 如何消除污染 机器运行完后 取出 PCR 产物时不能随便丢弃 应该用塑料手套或其他打结包好后 丢入垃圾桶 1 试剂 mixer 尽量分装 不要原瓶多次取用 2 加样 原则是 DNA 最后加 其他试剂按照体积大小从大往小的加 如果是同种引 物和探针有多管的话只是 DNA 不同 那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面 混合均匀之后再分装到各个管子里去 这样可以有效地避免误差及污染 另外 普通实验室容易污染 且污染程度很高 与跑电泳还有质粒制备提取都在同一 个房间里有比较大的关系 最容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释 目前 国内外各个公司提供的诊断试剂盒大多采用了 UNG 来防污染 Uracil DNA N glycosylase UNG 尿嘧啶 DNA 糖基酶 来源于大肠杆菌重组克隆表达 RNA 定量 RNA 也最好至少要用电泳 一方面定量 另一方面可以看看完整性 至于用分光光 度计比较 不同标本之间就更不准了 RNA 的贮藏 最主要的是温度 20 不够 最好 80 液氮最保险 mRNA 是不能代替蛋白水平的分析的 因为还有翻译效率和 RNA 降解速度的影响 RT PCR 有两种做法 条件具备的话可用 kit 进行一步法进行 若条件不太好的话可分两步进行逆转录再 PCR 两步法的结果更加理想 条带特异性强且无拖尾现象 由此推测是体系更加单一比 较利于 PCR 的进行 一定要做内参的 不作内参的结果是不可信的 电泳可以不一起跑 没有关系 计算的是相对表达程度 半定量和定量 RT PCR 做 的都是基因相对表达量 不是绝对表达量 mRNA 的分离与纯化中 步骤 4 中将 RNA 溶液置 65 中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个 一个是破 坏 RNA 的二级结构 尤其是 mRNA Poly A 尾处的二级结构 使 Poly A 尾充分暴露 从而提高 Poly A RNA 的回收率 另一个目的是能解离 mRNA 与 rRNA 的结 合 否则会 导致 rRNA 的污染 所以此步骤不能省略 下面 我们介绍一个可以确认 RNA 溶液中有没有残留的 RNA 酶的方法 保温试验 方法很简单的 按照样品浓度 从 RNA 溶液中吸取两份 1000 ng 的 RNA 加入至 0 5 ml 的离心管中 并且用 pH7 0 的 Tris 缓冲液补充到 10 ul 的总体积 然后密闭管盖 把其 中一份放入 70 的恒温水浴中 保温 1 h 另一份放置在 20 冰箱中保存 1 h 时间到了之后 取出两份样本进行电泳 电泳完成后 比较两者的电泳条带 如果两 者的条带一致或者无明显差别 当然 它们的条带也要符合方法 2 中的条件 则说明 RNA 溶液中没有残留的 RNA 酶污染 RNA 的质量很好 相反的 如果 70 保温的样本 有明显的降解 则说明 RNA 溶液中有 RNA 酶污染 PCR 污染与对策 PCR 扩增产物污染 这是 PCR 反应中最主要最常见的污染问题 所以 扩增区的仪器 什么如枪头等要注意 还有一种容易忽视 最可能造成 PCR 产物污染的形式是气溶胶污染 在空气与液体面 摩擦时就可形成气溶胶 在操作时比较剧烈地摇动反应管 开盖时 吸样时及污染进