活力测定细胞复苏

,细胞计数及活力测定,一、实验目的：1掌握细胞计数的方法2. 掌握测定细胞活力的方法。,二、实验原理,培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。,三、实验材料,仪器、材料与试剂1仪器：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、分光光度计。2材料：细胞悬液。3试剂：0.4台盼兰，0.5四甲基偶氮唑盐（MTT）、酸化异丙醇,四、操作步骤1细胞计数将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。静置3分钟。,计数 ：在低倍镜下计算计数板的四角大方格（每个大方格又分16个小方格）内的细胞数。数出计数板上计数室四角四大格中的细胞数，如细胞压在格线上时，数上不数下，数左不数右。,细胞浓度计算： 四大格的细胞总数除以4，得出平均每大格的细胞数，每大格的容积为0.1mm3，因此，不同稀释倍数细胞悬液的细胞浓度可用下式计算：细胞浓度（细胞数ml）（四大格的细胞数4）10000稀释倍数注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液,2细胞活力测定,在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。,台盼蓝活力测定机理：正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。,将一定浓度的细胞悬液与0.4%台盼兰以9:1混合。染色2一3分钟。吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。另外，活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。,细胞的冻存和复苏,一、实验目的,掌握细胞冻存的方法。,二、实验原理,在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、蛋白变性等，引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的50，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。,影响冷冻效果的因素,1、冷冻速率细胞冷至-10-15之间时，细胞外溶液先出现结冰，而细胞细胞内仍保持未结冰状态、细胞内未结冰的水分子会向细胞外流动。冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞内溶质浓度增高、细胞不发生结冰。冷冻速度快，细胞内水分没足够时间外渗，会发生结冰。,2、冷冻保存温度 液氮（-196 ）是最佳保存温度。3、复温速度 越快越好，37 水浴中，1-2min完成复温。4、冷冻保护剂 保护细胞免受冷冻损伤的物质，常用甲亚砜（DMSO）和甘油。,三、实验材料,1仪器：4冰箱，-70冰箱，液氮罐，离心机，水浴锅，微量加样器等2材料：冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管等。3试剂：0.25胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）等。,四、操作步骤1冻存 胰酶消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中。 1000rpm离心5分钟，弃上清液。 沉淀加含保护液的培养基（培养基：DMSO=1:1），计数，调整至5106/ml左右。 将悬液分至冻存管中，每管1 ml。,将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。按下列顺序降温：室温4（20分钟冰箱冷冻室（-20 ）（1小时）气态氮（过夜）液氮。注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用11.5月。,2复苏从液氮中取出冻存管、迅速置于37温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。1000rpm离心10分钟，弃去