牛奶中成分分析

牛奶中部分成分的分析牛奶中部分成分的分析 一 实验目的一 实验目的 1 学习利用等电点沉淀法从牛奶中制备酪蛋白 2 掌握双缩脲法测定蛋白质的原理和方法 3 熟悉可见光分光光度计的操作 4 加强对沉淀 抽滤 溶液配制等基本操作的锻炼 5 分析牛奶中蛋白质与钙的含量 6 掌握配位滴定法测定液体食品中钙含量的原理和方法 7 通过与牛奶包装上注明的含量比较 对实验分析结果进行客观评价 二 实验原理二 实验原理 牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白 含量约为 35g L 酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合 物 等电点为 4 7 利用等电点时溶解度最低的原理 加入醋酸将牛乳的 pH 调至 4 7 时 使酪蛋白沉淀出来 用乙醇洗涤沉淀物 除去脂类杂质 抽滤 纯化后便可得到纯酪蛋白 双缩脲 NH2CONHCONH2 在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物 称为双缩脲 反应 蛋白质分子中含有许多肽键在碱性溶液中也能与 Cu2 反应产生紫红色化合物 在一 定范围内 其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比 因此 可以利用比色法测定蛋白质浓度 双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一 操作简便 迅速 受蛋白质种类性质的影响 较小 但灵敏度较差 而且特异性不高 除 CONH 有此反应外 CONH2 CH2NH2 CS NH2等基团也有此反应 钙与身体健康息息相关 钙除成骨以支撑身体外 还参与人体的代谢活动 它是细胞 的主要阳离子 还是人体最活跃的元素之一 缺钙可导致儿童佝偻病 青少年发育迟缓 孕妇高血压 老年人的骨质疏松症 缺钙还可引起神经病 糖尿病 外伤流血不止等多种 过敏性疾病 补钙越来越被人们所重视 牛奶中含有易被人体吸收得钙 有些牛奶产品中 还特地加钙而成为钙奶 对于液体牛奶中钙的含量 可采用 EDTA 法进行直接测定 考虑到牛奶中含有 Fe3 Al3 等干扰离子 可以加入少量三乙醇胺以消除它们的 调节 pH 12 13 以铬蓝黑 R 作指示剂 指示剂与钙生成红色的络合物 当用 EDTA 滴定至计量点时 游离出指示剂 溶液呈现蓝色 三 材料 试剂与仪器三 材料 试剂与仪器 一 材料 一 材料 新鲜牛奶 加钙牛奶 二 试剂 二 试剂 95 乙醇 无水乙醚 醋酸 醋酸钠 NaOH CuS04 5H2O 酒石酸钾 碘化钾 牛血 清蛋白 BSA EDTA 基准物质 CaCO3 HCl 三乙醇胺 铬蓝黑 R 盐酸羟胺 邻二 氮菲 邻菲啰啉 浓硝酸 硫代硫酸钠 甲基红 氨水 1 0 2 mol L 1 pH4 7 醋酸 醋酸钠缓冲液 先配 A 液与 B 液 A 液 0 2mol L 醋酸钠溶液 B 液 0 2mol L 醋酸溶液 取醋酸钠固体 1 64g 加水溶解并稀释至 100ml 取冰醋酸 1 37mL 加水稀释至 120ml 取 A 液 94 79mL B 液 105 21mL 混合即得 pH4 7 的醋酸 醋酸钠缓冲液 200mL 2 乙醇 乙醚混合液 乙醇 乙醚 1 1 V V 3 NaOH 6mol L 1 称取 12g 氢氧化钠溶于 50mL 水中 4 双缩脲试剂 称取 CuS04 5H2O 3 0g 酒石酸钾 9 0 g 和碘化钾 5 0g 分别溶解后混匀 加 6 mol L 1NaOH l00mL 最后加水至 1000mL 贮于棕色瓶中 避光 可长期保存 5 0 9 NaCl 6 蛋白质标准液 10mg mL 1 用小烧杯称取干燥的牛血清蛋白 100 0mg 以少量生理盐水 溶解后倒入 l0mL 容量瓶中 淋洗小烧杯数次 一并倒入容量瓶中 最后加生理盐水至 刻度线 7 待测蛋白样本 将牛奶样品用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定 将制得的 酪蛋白用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定 如若不能溶解 滴加几滴 6mol L NaOH 溶液 分别用 l0mL 容量瓶定容 8 EDTA 0 01mol L 1 称取 2 0g EDTA 二钠盐 用温热水溶解后 稀释至 500mL 储存 于聚乙烯塑料瓶中 9 CaCO3标准溶液 0 01 mol L 1 准确称取基准物质 CaCO30 1g 左右 先以少量水润湿 再逐滴小心加入 6 mol L 1HCl 至 CaCO3完全溶解 定量转入 100mL 容量瓶中 以水 稀释至刻度 并计算其浓度 10 NaOH 5 mol L 1 11 HCl 6 mol L 1 12 三乙醇胺 200g L 1 13 铬蓝黑 R 5 g L 1 乙醇溶液 三 仪器 三 仪器 试管 移液管 1mL 5mL 20 mL l0mL 容量瓶 烧杯 表面皿 250mL 锥形瓶 1000mL 棕色试剂瓶 25mL 具塞比色管 试管架 坩埚 60mL 分液漏斗 水浴箱 可见光分光光度计 离心机 抽滤装置 精密 pH 试纸 可测 pH4 7 酸度 计 电炉 温度计 四 操作步骤四 操作步骤 一 牛奶中酪蛋白的提取 一 牛奶中酪蛋白的提取 1 酪蛋白的粗提 酪蛋白的粗提 50mL 鲜牛奶加热至 40 在搅拌下慢慢加入预热至 40 pH4 7 的醋酸缓冲液 50mL 用精密 pH 试纸或酸度计调 pH 至 4 7 将上述悬浮液冷却至室温 离心 15 分钟 3000 r min 1 弃去清液 得酪蛋白粗制品 2 酪蛋白的纯化 酪蛋白的纯化 用水洗涤沉淀 3 次 离心 10 分钟 3000r min 1 弃去上清液 在沉淀中加入 30mL 乙 醇 搅拌片刻 将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤 用乙醇 乙醚混合液洗沉淀 2 次 最后用乙醚洗沉淀 2 次 抽干 将沉淀摊开在表面皿上 风干 得酪蛋白纯品 3 准确称重 计算含量和得率 准确称重 计算含量和得率 含量 酪蛋白 g 100 mL 牛乳 100 到到到到 到到到到到到到 到到 二 酪蛋白含量的测定 二 酪蛋白含量的测定 1 标准曲线的绘制与样品的测定 标准曲线的绘制与样品的测定 取试管 8 支 按下表操作 123456测定管1测定管2 蛋白质标准液 mL 0 200 400 600 801 00 待测蛋白样品 mL 1 001 00 0 9 NaCl mL 1 000 80 600 400 20 双缩脲试剂 mL 4 004 004 004 004 004 004 004 00 吸光度 A 各管混匀 放置 37 水浴中保温 20min 540nm 比色 以空白管调零点 读取各管吸 光度值 2 计算 计算 在电脑上以吸光度值为纵坐标 以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线 从标准曲线中 查出待测样本的蛋白质浓度 g L 并求出牛奶中蛋白质浓度 由此浓度计算出 100mL 鲜 牛奶中酪蛋白的真实含量 三 钙含量的测定 三 钙含量的测定 1 EDTA 溶液浓度的标定 准确移取 20 00mL CaCO3标准溶液 3 份分别于 250mL 锥形瓶中 加入 2mL NaOH 溶 液 铬蓝黑 R 指示剂 3 4 滴 用 EDTA 溶液滴定至溶液由红色变为蓝色即为终点 根据滴 定用去 EDTA 毫升数和 CaCO3标准溶液的浓度 计算 EDTA 溶液的浓度 2 钙制剂钙含量的测定 准确移取一定量的鲜牛奶和钙奶 分别转移到 100mL 容量瓶中 用水稀释至刻度 摇 匀 准确移取上述试液 20 00mL 加入三乙醇胺溶液 5mL 5mol L 1NaOH 4mL 加入水 20mL 摇匀 加铬蓝黑 R3 4 滴 用 0 01mol L 1EDTA 标准溶液滴定 接近终点时再补加 2 3 滴铬蓝黑 R 当溶液由红色变为蓝色即为终点 根据消耗 EDTA 的体积 计算出鲜奶 和钙奶中钙的含量 g 100 mL 并与包装上注明的含量作比较 3 注意事项 量取鲜奶和钙奶的量视钙含量多少而确定 以