527-RACE心得体会.doc

如果您顺的话，一个礼拜足矣！同意，5-RACE确实比较难，但也有顺利的时候，我上周做5-RACE也一次就成功了，我觉得关键还是RNA 的质量，如果RNA模板质量不好，后面做得再认真也是白费！当时要克隆基因的5GC含量达到了80%，一般的反转录酶和PCR都拿不到，后来加了海藻糖60度反转录一个小时后，用TaKaRa的GC-Buffer和LA-Taq才扩出来，当时就为了这个5端，很是费了力气。如果RCR产物不是很特异或没有目的条带的话，建议用nest PCR。在做5时，对RNA要求比较高，最好用新鲜的组织提，随即做逆转录，扩增。做RACE PCR条带单一的不多，尽可能的回收与目的片段大小相近的条带。克隆的时候，一般kit上建议挑8-10个克隆，多一个，多一份希望，因为RACE，尤其是5太难了，我作了约6个月。偶没有买试剂盒，自己合成了3条引物，买了反转录酶。然后一次就出来了。RACE的盒子最常用的是CLONTECH和INVITROGEN的，这个方法我也试过很多次了，方法很简单，但是作出来效果非常的不理想。PCR出来的东西都是杂七杂八的东西，更多的时候是弥散的条带。SmartRace 既然称之为Smart，因为它的引物能特异的识别5端帽子位点，因此排除了所有非完全的逆转录。再加上使用基因特异性引物，使其做出来的可能性更大。这个方法省钱，但是我不是很看好，祝好运。另，建议你不要用oligodT进行逆转录，在基因mRNA300bp处设计一条或几条基因特异性逆转录引物更好。希望你能有好结果。我刚做过5、3 RACE，我个人的经验如下：1、首先，提的RNA必须完整，最好跑个RNA电泳来验证一下；2、设计引物时要注意：Tm最好大于70度，两引物间要有100-200bp的重叠区；3、用巢氏PCR相对容易出结果；4、如果出现多个条带，要分别验证；5、PCR过程中，我一般分两次，第一次用touchdowm PCR，后产物稀释50倍，作二次，72度尽量长一点，我们一般用2-3min；6、结果分析，最好是重叠区吻合，否则，应重新做。这里有两个原因：1、Tm大于70度，好做touchdown PCR；2、相应加长引物，可以更有效地扩增，尤其是针对丰度低、比较难扩的产物。RACE是采用PCR技术由已知的部分cDNA顺序来扩增出完整的cDNA 3 和5 端的方法，又被称为单边PCR(one-sided PCR)和锚定PCR(anchored PCR)。3-RA CE的般过程是：以oligo(dT)17和在许多文章中被称为锚引物(anchor primer)或接头(adaptor)的序列组成的引物QT逆转录mRNA得到第一条cDNA链，然后用含部分锚引物序列的引物Q0与基因特异性引物GSP1进行第一轮扩增得到双链cDNA ，第二轮扩增则采用内部引物(nested primer)Ql和GSP2，以防止产生非特异性扩增产物。采用同样的原理可以进行5-RACE,先用基因特异性引物GSP-RT逆转录mRNA 获得cDNA第一条链I然后用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和dATP在cDNA 5 端加上poly(A)尾巴再使用(1)QT引物合成cDNA第二条链；(2)Qo和一个在GSP-RT上游的引物GSP1扩增cDNA,最后采用内部引物Q1和GSP2进行第二轮PCR扩增以提高特异性。扩增后得到的双链cDNA用限制性内切酶酶切和Southern杂交分析并克隆，得到5特异性和3特异性的cDNA文库。从两个有相互重叠顺序的5和3 RACE产物中可以获得全长cDNA，或者可以分析5 和3 端顺序，合成相应引物扩增出全长cDNA 。目前,对于扩增基因的5端还没有一种完美的技术,RACE 也不例外,特别是5RACE 对于得到的克隆(经检测后为阳性克隆),通用的做法是挑选10个以上的单克隆送去测序.就我个人经验,也是挑了5个才测到我的目的基因的.建议你用clontech 的smart race试剂盒,我以前用的也是TAKARA的,结果做了N 次都没出来,换试剂盒后一次就做出来了.合成单链CDNA后,用TAQ酶来合成第二条链,也就是相当于双链DNA中的另一条链,用的是上游引物,按照碱基互补的原理,在酶的作用下完成.我刚刚做过RACE，其实当时本来买试剂盒准备建cDNA文库的，但是库建的不好，杂交了好几次都没杂出东西来，后来用它的接头引物和基因特异性引物扩增，最初只设计了特异性引物的巢式引物，最初扩不出东西来，后来把接头引物也设计了内部引物，而且pcr时把模板的量加大，因为可能模板少也很难扩出来，我们都用该方法扩的，都出来了，当然有时有多条带需验证是否单引物扩增产物。这是我做实验的体会，祝大家早日出结果。SMARTTM 5-RACE的原理是先是利用mRNA的3末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5末端时自动加上3一5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头(figure 2 )。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作为上游引物，用一个基因特异引物2(GSP 2 genespecific primer,GSP)作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5末端的cDNA片段扩增出来。最终，从2个有相互重叠序列的3 / 5-RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3和5端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。我们在实验中发现，要做好RACE反应实验不容易，实际操作中仍存在不少困难。因此，对RACE反应条件进行反复摸索是实验必须要做地。这是因为:第一，在5-RACE包含了有3个连续的酶反应步骤(反转录、同聚物加尾和PC R扩增)，每一步都可能导致失败;第二，扩增。DNA末端的特异性完全依赖锚定引物及扩增DNA模板样品不均一性，因而特异性一般很低，常呈现不清晰的成片条带或截短的产物背景。因此，使用RACE技术扩增得到的特异末端片段，所获得的重组克隆最好能够全部测序，以排除RACE实验结果中扩增产物假阳性和假阴性，最终有可能获得新基因的全序列。我们相信，第一链，同时利用它的加尾特性在合成的cDNA链3加上3-4个dCTP，而且当帽子结构存在时该酶的加尾活性最高（对全长分子的富集机制），随后这3-4个碱基与体系中事先加入的引物（该引物的3端有3-4个dGTP）配对，MMLV继而以聚合酶活性将配对引物补成双链。目前基于该技术的试剂盒只有Clontech公司生产，全名为SMART RACE cDNA amplification kit（Cat634914）流程见图：该方法的突出优点就是操作简便，成功率较高，全场分子的比例较高。cDNA第一链的合成和加尾一步即完成，避免了其他方法中对mRNA和cDNA链的反复操作，降低了mRNA降解和合成产物丢失的风险，使本来就含量甚微的全长分子得到最大保存，所以这种方法得到了广泛认可，应用最多。如果加上RNA提取时间，这种技术可以在3个小时内得到加上接头的cDNA产物，最大限度地降低了mRNA的降解风险。2、Oligo capping method方法（又称RLM-RACE）是由日本东京大学铃木等人开发，可以更精确的定位转录起始位点。我们知道真核生物的mRNA具有一个3尾巴和一个5帽子结构，该技术正是利用5端的帽子特性对全长分子进行富集和扩增。降解的mRNA5端都有一个磷酸基，用碱性磷酸酶去掉该磷酸基，随后用烟草酸性焦磷酸酶去掉帽子结构，则全长分子的5端会暴露出磷酸基，随后的连接步骤中锚定引物将特意的加在全长分子的5端而不会和降解的分子连接（全长分子的富集机制）。目前基于该方法的试剂盒有TaKaRa（5-Full RACE kit D315）和Ambion（Firstchoice RLM-RACE kit AM1700）两家都有生产，步骤如图：该方法的最大优点就是全长分子的比率高，可以说只要是扩增产物就肯定是全长分子。但是该方法的最大缺点是操作复杂，而且都是针对mRNA分子进行操作，使mRNA分子降解的风险极大提高，所以成功率不是很高。对于新手和实验室条件较差者不推荐使用该试剂盒。3、Self-ligation技术。基因特异性（或者OligodT）反转录合成cDNA第一链，RNase H降解杂合链中的RNA，连接酶连接纯化后的cDNA链，在已知片段上设计反向PCR引物进行未知片段的扩增。该试剂盒宝生物以前有售，现在已停产，原理如图：该试剂盒想法十分好，但是由于没有全长分子的富集机制，得到全长分子的几率比较低。而且在实际使用中它的扩增片段都比较短，不能满足实验要求。4、Anchored PCR方法。利用一条基因特异性反转录引物，在反转录酶的作用下合成cDNA第一链，将RNA-DNA杂合链中的RNA降解纯化后，利用末端转移酶在cDNA链的3端加入PolyC尾巴（尾巴长度不能确定），然后利用abridged anchored primer和一条基因特异性引物扩增（可能需要巢式PCR才能得到结果）。该试剂盒有Clontech（Marathon cDNA amplification, Cat: 634913）和Invitrogen（5RACEsystem for rapid amplification of cDNA ends, Cat: 18374-058）公司在售，操作简图如下：该法最大的缺点是全长分子的比率较低，而且操作复杂，整个实验流程需要耗费超过一天的时间。这种方法没有像SMART和Oligo capping method中那样采取对完整分子的富集机制，所以它依赖于高质量的反转录酶（具有通读复杂二级结构的能力、具有较高的反应温度）和高质量的RNA，否则得到全长分子的几率会很低。你这个就是利用的invitrogen的5RACE试剂盒的原理啊。自己只需要买TdT和dCTP就行了，既方便又省钱，我们实验室就是这样做的。RT产物的纯化只需要用普通的胶回收试剂盒就行了，我们实验室用的是Omega的。至于第二点的话当然可行啊，你有什么顾虑呢？呵呵，300bp应该不难。建议你，做每一步时都有个证明每个步骤是否出错得对照。模版的质量应该要高。我做了一次，每次温度都有条带，也包括我要的大小的这不回收了，准备节后测序呢。有人告诉我，第一轮的温度只要是软件建议的温度就可以了，第二轮则比你一轮高3-5度，然后多5-10个循环就可以了。我觉得做race关键就是提rna，只要这部没有问题，其他的都好说了。恭喜sos888151000，5做完了，3就容易多了。我们实验室根据Invitrogen的5RACE原理，自己买试剂，也能做出5RACE。也就是做个锚定PCR。模板RNA的质量非常重要。略有不好，5-RACE就很难出结果；3容易一些RACE在我们实验室也做了一些,目前扩了8个FL,还算有点经验和教训.TAKARA和INVTROGEN的都试过,感觉INVITRO的好些,但是都做出来了.首先,我认为mRNA质量很关键,但是最重要的你的目标基因的丰度,如果丰度够高,还是比较容易做的,所以一般来说我们在做RACE之前都会做个TISSUE DISTRIBUSION.其次,5-RACE的关键是出带,带出来了,一般情况都是特异性的,不需要过多的验证.3-RACE不一样,需要一对存在于已知片断里面的保守引物做验证和筛选,这可以节省很多的时间和金钱.千万不要试图用AUAP这种通用引物做验证和筛选,成功率很低.最后说说试剂的选择吧,TAKARA用的是试剂盒,感觉比较便宜,但是成功几率较小(做3次才成功).不过它配的RT-PCR酶比较好,是AMV.而INVITRO的感觉没必要买他的试剂盒,因为价格贵,而且里面大多数东西都用不到.INVITRO的我是单独买的tdt,SUPERSCRIPT III,以及AAP,其余的用其他公司的代替,引物直接合成(如AUAP).这样成本会大大下降.不过记住,在做5-RACE的时候,产物纯化试剂盒一定用进口的,国产的效率太低,而且DTT似乎去不干净.这两个试剂盒的PROTOCOL条件似乎都不怎么好(不知道是不是在我们实验室水土不服),需要自己摸索条件,特别是在MG浓度和TM上面,我们一般都是用GRADIENT.PCR的酶一般的就可以,我们都是用国产的.我也做RACE呢,也是没有出来，我觉得引物最重要,侃侃你的引物合适么?还有cDNA,作个内参;dNTP不能反复冻溶;最好分装,等液体完全融化后在加样品!简要整理了一些基本的东西，希望有用。RACE（cDNA末端快速扩增，Rapid Ampliphication of cDNA Ends）是一种获得转录本5或3未知序列的方法。不象普通RT-PCR那样使用两个序列特异性的引物，RACE使用一个序列特异性的引物和或者mRNA的poly(A)尾（3 RACE）或者加到cDNA末端的多聚同聚体（5RACE）。RACE的产物可以用来克隆，直接测序，制备探针或连接在一起得到全长cDNA。其中一个连接5 和3 RACE产物的方法是使用由5 及3 RACE得到的序列信息设计新的引物，以扩增全长的cDNA。使用RNaseH-的逆转录酶和高保真的热稳定聚合酶可以对较长的序列进行高保真的扩增，从而得到全长cDNA克隆。RACE已经被用于扩增和克隆稀有mRNA。5 RACE步骤概要 ：第一链引物，GSP1，同mRNA退火使用SuperScript将mRNA转录成cDNA使用RNase混合物降解RNA纯化cDNA （可以使用试剂盒）使用dCTP和TdT对纯化的cDNA加尾使用简并的锚定引物和巢式GSP2 PCR扩增带有dC尾的cDNA使用巢式GSP重新扩增初步PCR产物。5 RACE的产物可能是单一产物、多个产物，甚至是不能分辨的连续条带。结果的质量取决于用来合成第一链和扩增的GSP的特异性、扩增所使用锚定引物的特异性、目的mRNA的复杂度和丰度及产物的长度。使用巢式引物扩增（最多可以三轮巢式扩增），并在连续几轮扩增中使用长度选择性的扩增产物作为模板可以增加5 RACE的特异性。增加逆转录保温温度和PCR退火温度，并降低扩增反应中的镁离子浓度可以促进特异性。5 RACE的灵敏度受所使用的逆转录酶和cDNA 3 末端抑制cDNA加尾的二级结构影响。cDNA的不完全合成降低了全长产物的产量，并导致某些模板产生连续条带。因为SuperScript产生更多的全长cDNA，所以可以提高5 末端序列检测的水平，尤其是对于小于1kb的转录本。双链3 末端和发卡结构会通过减少用于加尾的3 羟基而破坏cDNA的加尾。cDNA的起始保温温度在94并随后在冰上冷却有助于破坏二级结构。一些困难模板可能需要加入DMSO辅助加尾。加尾酶末端脱氧核苷转移酶可以耐受最多20的DMSO。各位GGJJ:我初次做RACE,我老板资金有限我没有用试剂盒.用的自己的方法.第一次P用的降落PCR,出来的条带呈弥散状.我用这个产物做巢式PCR,结果没有条带.怎么办呢?是不是引物不行?望各位大虾赐教啊!我用的方法是（1）用oligo dT 得到 cDNA，用的宝生物的试剂盒；（2）纯化 cDNA，用的申能博采的PCR纯化试剂盒；（3）用 TdT（末端脱氧核糖核酸转移酶）将 cDNA 的 3 末端加上 dCTP；（4）以 3 末端加上 dCTP 的 cDNA 为模板进行第一轮 PCR，上游引物使用从 5 至 3 依次为含有酶切位点的通用引物序列 + 10 个 dG，比如 5- GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGG GGG GGG -3下游引物使用基因特异的引物；（5）为提高特异性，第一轮 PCR 使用含有多个 dG 的通用引物和比较靠近基因 3 末端的特异引物，第二轮 PCR 以第一次 PCR 产物为模板，引物则使用含有多个 dG 的通用引物和比较靠近基因 5 末端的特异引物；（6）PCR 产物电泳，回收，连接相应载体1 首先考虑你RACE基因的大小，1.5kb左右的片段按照这个方法作出来的可能性比较大，超过1.5kb就不太容易了。2 cDNA的纯化建议使用宝生物的核酸共沉剂，用PCR纯化试剂盒回收cDNA效率应该不会太好。3 PCR酶的选用和引物设计也很重要，你选用的5- GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGG GGG GGG -3在5端存在二级结构，开键的自由能较大，建议该为5-CGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG -34 RT-PCR的模版含量可能过高，建议稀释十倍后使用。有很多时候采用浓度低的cDNA反而刻意达到较为满意的试验结果。1、想知道你的已知片断是多大的，要是很大，设计反转录引物的时候应该考虑从已知cDNA序列片断中靠近5端设计特异性引物，控制已知部分反转录产物500bp-600bp。当然，如果你的未知片断很大，还要适当缩小已知片断。特异性反转录可以去掉好多干扰。2、不买试剂盒，也可以按照试剂盒的方法去做，考虑环化，比加尾效率要高。3、 模板量要稀释。5RACE最重要的是RNA没有问题。然后再做后来的工作，不知道你用的是什么样的试剂盒，我觉得逆转录酶很重要，我尝试了用各种方法，包括你的末端加尾的方法都没有成功，可能这种方法真的得不偿失。后来用了clonetech的逆转录酶和它的寡核苷酸链，很快就做出来了，其他的引物自己设计就可以了。经验：1。总RNA质量要高，先电泳看28s18s，28s亮度应该是18s的2倍。2。总RNA的量可远大与其要求的上限5ug，但要相应延长酶反应时间。3。pcr条件要自己摸，gsp的量可参考其要求的量，但其要求的dNTP量似乎偏大，自己要摸一下的dNTP量。4。一定要用高保真酶taq酶。附上我的race pcr电泳图。第一你的这段序列是来在实际测序还是从预测序列得到的？如果是从网上下载的，那你就要注意这里面就有不可信了。我作5race，根据预测序列设计的引物就有问题如果是你实际测的序列，那么你就要考虑引物设计的因素了。不知道你用的是那个公司的试剂盒。我是参照bd公司的smart race kit manual做的。我作race的时间也不长，只能把我的感受到的有限的经验教训告诉你，不对之处请大家指正。1.引物设计要遵循一般引物设计的原则。尽量避免发夹结构（实在避免不料了要选取发夹形成碱基不超过5个的）。瞅了一下你的引物，我认为引物的5尽量以g/c开头，但是按照分子克隆上说，5最前端不要连着出现gc，这样结合特异性会降低。2，我采用的是bd公司的策略，他要求设计的引物Tm最好大于65度。后来在实验中证明这一点还是有道理也比较关键的。因为按照试剂盒说明书，它作5race时3gsp是和上游的通用引物配对的，通用引物中有一种长引物，tm很高，也很长，这就要求特异引物tm高一点。3 5race确实存在难度，加之race技术本来有说不清的东西。你没有作出来未必是因为引物的问题。如果你普通的pcr没有结果，可以试试touchdown pcr但是实际上我倒觉得touchdown 不好作，我拿普通的pcr作出来了，touchdown条件一直掌握不好，易出现弥散4，建议你设计引物不要设计一条，最好设计几条，尤其是针对5race你可以设计几条有一定间隔、但是距离不很远的引物。好处在于，a）万一拿一条作不出来可以试试其他的，节省时间；b）可以拿最下游的引物与5通用引物配对先扩，如果扩出来得效果不好，可以拿这一轮pcr产物作模板，以该3gsp稍微上游一点的引物再和通用引物配对扩增更多的情况是，race很容易出现非特异性带，拿这种类似与巢式pcr的策略可以减少非特异带，或者判断条代5 最后建议你5race时，3gsp接近5端为好，但是我师兄建议我扩增条代短一点扩增的效率和几率要大一些。好的引物所具有的令人满意的特点：* 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。* 选择GC含量为40到60或GC含量反映模板GC含量的引物。* 设计5端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。* 避免引物对3末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。* 避免3末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。* 避免3末端的错误配对。3端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。* 避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。5Race是很难做呀。你这种情况我觉得是特异引物不特异。我的建议是先按照一般pcr的优化方式试试看。比如：降低模板浓度（梯度），用降落PCR，热启动，降低酶浓度