无机及分析化学(第二版)第十二章

第十二章 色谱分析法,知识目标：掌握色谱法的原理、分类及有关概念；熟悉薄层色谱法、纸色谱法的原理及技术要点；理解气相色谱法的基本原理，熟悉气相色谱仪的基本结构；理解气相色谱定性的依据；了解气相色谱定量的方法；了解高效液相色谱的特点和应用。,能力目标：能够正确选择色谱方法，并完成薄层色谱法、纸色谱法分离实验操作；能根据被分离组分的极性正确选择吸附剂和脱附剂；能说出气相色谱仪基本结构；熟悉气相色谱定性的几种方法；能说出高效液相色谱法与气相色谱法的不同特点。,第一节 概述,一、色谱法基本原理,色谱法又称为层析法，是一种依据物质的物理化学性质的不同而进行分离的分离分析方法。其分离原理是利用混合物中各个组分的物理化学性质差异，使各个组分以不同程度分布在两个相中而得以分离的方法。其中一个固定的相称为固定相。另一个相流过此固定相进行冲洗，称为流动相。在冲洗过程中各个组分在两相间经过反复的吸附、解吸附或重复分配后，以不同速率移动，从而达到分离。,吸附色谱的吸附-解吸平衡状态，可用吸附平衡常数(吸附系数)K表示。在低浓度和一定温度下：,K=cs/cm,式中cs为组分在固定相中的浓度，cm为组分在流动相中的浓度。K实际上是溶质分子在固定相和流动相达到平衡时的浓度之比。各组分之间K值越大，越容易被分离。,二、色谱法的分类,色谱法有多种类型，通常有以下三种分类方法：,按两相所处状态不同分类,液相色谱法,气相色谱法,流动相为液体，当固定相为固体吸附剂时，称为液-固色谱；当固定相为液体，称为液-液色谱。,流动相为气体，当固定相为固体吸附剂时，称为气-固色谱；当固定相为液体，称为气-液色谱。,按操作形式不同分类,柱色谱法,薄层色谱法,将固定相装于柱管内，构成色谱柱，利用色谱柱分离混合组分的方法。,以滤纸作为载体，以滤纸上面吸附的水作为固定相，然后与薄层色谱法相同的操作形式进行分离分析的方法。,将固定相涂铺在平板上，制成薄层板，点样后，用展开剂(流动相)将其展开，然后用薄层板斑点定位后进行定量和定性分析的方法。,纸色谱法,按色谱过程的分离原理分类,吸附色谱法,分配色谱法,离子交换色谱法,分子排阻色谱法,用吸附剂作固定相，利用吸附剂表面对不同组分吸附能力的差异来进行的分离分析方法。,用液体作固定相，利用不同组分在互不相溶的两相溶剂中的分配系数的差异来进行的分离分析方法。,用离子交换剂作固定相，利用离子交换剂对不同离子的交换能力的差异进行的分离分析方法。,用凝胶(或分子筛)作固定相，利用凝胶对分子大小不同的组分有着不同的阻滞作用(或渗透作用)来进行的分离分析方法。,第二节 液相色谱,一、纸色谱法,1. 原理,纸色谱(PC)是以滤纸为载体的色谱法，固定相一般为纸纤维上吸附的水，与水不相混溶的有机溶剂为流动相。但是在实际工作中也常选与水相混溶的溶剂为流动相。各组分在滤纸上移动的位置用比移值(Rf)表示，如下图所示：,Rf值测量示意图,Rf=原点到斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离,图中，试样A的Rf=a/c, 试样B的Rf=b/c,根据Rf的定义，其值应在01之间变化。若组分的Rf=0，表明该组分停留在原点上，没有随展开剂展开；若组分的Rf=0.7，则表明该组分从原点移动到溶剂前沿的7/10，试样中个组分的Rf值相差越大，表明分离的越充分。 Rf与分配系数有关，分配系数越大， Rf越小。,纸色谱法是一种微量分析方法。此法设备简单，易于操作，适合对微量试样进行分离、鉴定。,二、实验条件的选择,1. 色谱滤纸的选择,用于色谱分离的滤纸要满足下列条件：滤纸质地均匀，具有一定机械强度；滤纸松紧适宜，过疏使斑点扩散，过紧则流速太慢；纸质应纯，无明显的荧光斑点。,2. 固定相的选择,纸色谱是以吸着在纤维素上的水作固定相，纸纤维则是起到一个惰性载体的作用。在分离一些极性较小的物质或酸、碱性物质时，为了增加其在固定相中的溶解度。常在滤纸上吸留一些甲酰胺或二甲基甲酰胺、丙二醇或缓冲溶液等作为固定相。,3. 展开剂的选择,展开剂的选择要从欲分离物质在两相中的溶解度和展开剂的极性来考虑。在流动相中的溶解度较大的物质会移动的快，因而具有较大的Rf值。对极性物质，增加展开剂中极性溶剂的比例，可以增大Rf。增加展开剂中非极性溶剂的比例，可以减小Rf。,二、薄层色谱,1. 原理,薄层色谱法(TLC)是在纸色谱法的基础上发展起来的分析方法。将固定相均匀地铺在玻璃、塑料或金属薄膜板上，各组分在此薄膜上进行色谱分离。将被分离的试样溶液点在薄板的一端，在密闭的容器中选用合适的展开剂展开。由于固定相相对不同的物质的吸附能力不同，组分在吸附剂与展开剂之间不断地进行吸附与解吸的过程。,2. 操作方法,薄层板的制备以硅胶、氧化铝为固定相制备的薄板，一般厚度以250m为宜，若要分离制备少量的纯物质时，薄层厚度应稍大些，常用的为500-750m，甚至1-2mm。,(2) 点样溶解试样的溶剂一般用甲醇、乙醇、丙酮、三氯甲烷等挥发性的有机溶剂，最好用与展开剂极性相似的溶剂，应尽量使点样后溶剂能迅速挥发，以减少色斑的扩散。水溶性试样，可先用少量水使其溶解，再用甲醇或者乙醇稀释定容。适当的点样量，可使斑点集中，点样量过大，易拖尾或扩散；点样量过少，不易检出。,(3) 展开将点好样的薄板与流动相接触，使两相相对运动并带动试样组分迁移的过程称为展开。A：展开装置 常用的展开装置有直立型的单槽色谱缸、双槽色谱缸、圆形色谱缸和卧式色谱缸。B: 展开方式 薄层色谱有多种展开方式。如近水平展开、上行展开、多次展开、双向展开和径向展开等方式。,(4) 斑点定位薄层色谱展开后，对有色物质进行斑点定位，可直接在日光下观察，划出色斑。,三、定量和定性分析,定性分析方法斑点定位后，测出半点的Rf，与同块板上的已知对照品斑点的Rf对比， Rf一致，即可初步定型该斑点与标准品为同一物质。然后更换几种展开系统，如果Rf仍然一致，则可得到较为肯定的定性结论。,2. 定量分析方法受到多因素的影响，很难控制色谱条件的一致性，如点样量的精确度，展开后斑点面积的规则程度和测定方法的精确度，使薄层色谱法的定量分析工作处于“半定量”或者进行限量检查的阶段。,四、薄层色谱法的应用,薄层色谱法具有设备简单、操作方便、展开迅速、显色容易、能用腐蚀性显色剂等优点。因此常用于有机物的分离和鉴定，在药物分析、卫生监测、环境保护、氨基酸及其衍生物的分析等方面都被广泛应用。如，药物的真伪优劣的鉴别、纯度的检查等，卫生检验中大气水质中有害物质的分离和鉴定等。,第三节 柱色谱,一、原理,柱色谱法是把固体吸附剂填充在直立的填充色谱柱内。将要分离的溶液试样由顶端加入，然后连续地加入流动相或者洗脱液，随着展开剂自上而下流过，被分离的组分在吸附剂表面不断产生吸附-解吸，再吸附-再解吸的过程，不同的组分，与固定相的吸附能力有差异，与固定相吸附弱的组分，在柱内迁移速度较快，先流出色谱柱；与固定相吸附强的组分，在柱内迁移速度较慢，后流出色谱柱，从而达到分离的目的。,柱色谱中不同组分能否得到分离，主要取决于吸附剂和脱附剂的选择，一般要求：吸附剂有较大的表面积和足够的吸附力；对不同的化学成分有不同的吸附能力，与洗脱剂、溶剂及试样中各组分不起化学反应；吸附剂的颗粒应有一定的粒度，颗粒要均匀。,吸附、脱附剂的选择,常用流动相的极性由小到大的顺序是：石油醚环己烷四氯化碳苯甲苯乙醚三氯甲烷乙酸乙酯正丁醇丙酮乙醇甲醇水,吸附剂的吸附活性大小与其含水量有一定关系，含水量越高则活性越低，吸附能力越差，因此吸附剂使用前须在一定温度下烘干以出去水分，称为活化。,流动相的选择原则与吸附剂的吸附活性大小和被分离组分的极性有关。为了使试样中吸附能力稍有差异的各组分分离，就必须根据试样的性质，吸附剂的活性，选择合适极性的流动相。,流动相的选择,二、离子交换柱色谱,1. 原理,离子交换色谱法是利用离子交换树脂作为固定相，由流动相携带被分离的离子型化合物，在离子交换树脂上进行离子交换而达到分离和提纯的色谱方法。该方法分离效率高，尤其是还能用于性质相近的离子间的分离以及微量组分的富集和高纯物质的制备。,2. 离子交换树脂的类型,离子交换树脂是一种高分子的聚合物，在其网状结构的骨架上有许多可与待分离离子起交换作用的活性基团，根据这些活性基团的性质的不同，可以分成多种类型。,A：阳离子交换树脂 这类树脂活性基团一般为酸性基团，酸性基团上的H+能与溶液中的阳离子发生交换作用。根据酸性基团的强弱，可分为强酸型和弱酸型两类。强酸型树脂在酸性、中性和碱性溶液中都可以使用。而弱酸型阳离子交换树脂只适用于pH4的溶液。,B：阴离子交换树脂 这类树脂活性基团一般为碱性基团，酸性基团上的OH-能与溶液中的阴离子发生交换作用。根据碱性基团的强弱，可分为强碱型和弱碱型两类。如果活性基团为季铵基，则为强碱型阴离子树脂。强碱型树脂在酸性、中性和碱性溶液中都可以使用。,3. 离子交换树脂的应用,离子交换色谱操作简单，目前大量用于水的净化、天然药物有效成分的提取、除去干扰离子、环境保护、痕量组分的富集等方面。近年来，离子交换色谱法在有机化学、药物化学和生物化学等方面获得迅速发展。,第四节 气相色谱法,一、 气相色谱法的分类和特点,以气体为流动相的色谱法称为气相色谱法(GC)。它是在经典的液相色谱法的基础上，借助仪器技术而发展起来的一种分离分析方法。,1. 气相色谱法的分类,按固定相的物态 可分为气-固色谱、气-液色谱。按色谱原理不同 可分为吸附色谱、分配色谱。按色谱柱的不同 可分为填充柱色谱法、毛细管柱色谱法。,2. 气相色谱法的特点,气相色谱法具有分辨效能高，选择性好，试样用量少、灵敏度高、分析速度快及应用广泛等特点。主要用来分离测定一些气体及易挥发性物质。对于挥发性较差的液体、固体，需采用制备衍生物或裂解等方法，增加挥发性来测量。,二、 气相色谱的常用术语,1. 色谱图,经色谱柱分离后的试样组分通过检测器时，所产生的电信号对时间作图，所绘制的曲线称为色谱图流出曲线(如下图所示)。纵坐标为检测器响应信号(mV、mA),横坐标为保留时间。,色谱流出曲线,2. 基线,基线是在操作条件下，仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线。稳定的基线应是一条平行于横轴的直线，基线反映仪器(主要是检测器)的噪音随时间的变化。,3. 色谱峰,流出曲线上的突起部分称为色谱峰。正常色谱峰为对称形正态分布曲线、如果分离完全，每个色谱峰代表一种组分。一个组分的色谱峰通常用三项参数来说明：峰高或者峰面积，用于定量；峰位(用保留值表示)，用于定性；色谱峰宽度，用于衡量柱效。,两种物质在色谱图上表现出被完全分离，通常要求:这两种物质的色谱峰要从基线处有一定距离地彼此分开；色谱峰要窄。,4. 保留值,表示试样中各组分在色谱柱中停留的数值。用时间表示的保留值包括：保留时间(tR) 即从进样到往后某组分出现浓度极大值时的时间间隔，称为该 组分的保留时间。死时间(tm) 指从进样开始到空气峰出现的时间。调整保留时间(tR) 为试样进入色谱柱后为固定用所滞留的时间，又称为校正保留时间,三者之间的关系为： tR= tR- tm,5. 峰高(h)半峰宽(W1/2)和基线宽度(W),峰高(h)是指从基线到色谱峰顶的高度。半峰宽(W1/2)是峰高一半处的宽度。该参数说明分离条件的好坏，在实际工作中希望峰形窄一些好。基线的宽度(W)通过色谱峰两侧的拐点做切线，在基线上的截距称为基线宽度，又称为峰宽。该宽度除了用于衡量柱效外，还可以用来计算峰面积。,三、 定性方法,气相色谱法定性的目的是确定试样的组成，下述两种定性方法最常用。,1. 与纯物质对比,将某一组分的纯物质与被测组分在同一根色谱柱上，在相同条件下分别测得纯物质和被测物的色谱图，如果被测物和纯物质的保留值相同，可能为同一物质。,2. 加入纯物质增加峰高法,在试样中加入纯物质，绘制色谱图，对比加入纯物质前和加入后的色谱图。如果某一组分的峰高增加，表示样品中含有与纯物质相同的组分。,四、 定量方法,定量分析的依据是在实验条件恒定时峰面积与组分的含量成正比，因此可以利用峰面积或峰高定量。,1. 峰面积的计算,峰面积测量的准确度直接影响定量结果，不同峰形色谱峰必须采用不同的测量方法才能取得较准确的结果。,(1) 峰高乘半峰宽法 当色谱峰为对称峰，如峰高为h，半峰宽为W1/2，则峰面 积： A=1.065 h W1/2,式中，1.065为半峰宽校正系数。用该法测峰面积，方法简单方便在实际工作中经常应用。,(2) 峰高乘平均峰宽法 对于不对称峰用平均峰宽代替半峰宽计算结果较准确，平均峰宽即峰宽的0.15倍处的峰宽(W0.15)和0.85倍处的峰宽(W0.85)的平均值： A=1.065 h (W0.15+ W0.85),(3) 自动求积法 带有数据处理或色谱工作站的气相色谱仪能够自动打印或显示出峰面积及峰高。这类仪器测量的准确度高。,2. 定量方法,定量方法有外标法、内标法、内标对比法、归一化法等。,内标法,将一定量的纯物质作为内标物，定量加入到准确计量的试样中，注入气相色谱仪记录色谱图，根据测量组分的峰面积和内标物峰面积，计算待测组分的含量。此法称为内标法。由下式计算待测组分(i)的含量：,i=(Aifims)/(Asfsm)100%,式中， i为i组分在试样中的质量分数；Ai为i组分的峰面积；As为内标物的峰面积；fi和fs分别为组分和内标物的重量校正因子；ms为内标物的质量；m为试样的质量。,外标法,本法首先绘制标准曲线，即待测试样的纯物质配成一系列不同浓度的标准溶液，分别取一定体积，进行分析，测量其峰面积或峰高，以峰面积或峰高对标准溶液浓度作图，即得到标准曲线，然后再按相同色谱条件进行试样分析，测出试样峰面积或峰高，依据标准曲线，即可求算出待测组分的含量。,归一化法,若试样中所有组分都能流出色谱柱，并在检测器上都有响应，都有色谱峰，可用下式计算各待测组分的含量：,i=Aifi/(A1f1+A2f2+A3f3+Anfn)100% i=Aifi/ Aifi100%,第五节 高效液相色谱法,一、 概述,经典液相色谱法 使用普通固定相，因而柱效低，分离效能差，分析周期长而且不具备在线监测器，通常作为分离手段使用。,高效液相色谱法 采用高压输液泵将具有不同极性的单一或混合溶剂、缓冲液等流动相，泵入装有固定相的色谱柱，经进样装置注入供试品溶液，由流动相带入柱内，实行在线分离检测，具有自动化程度高、分离效能好，分析速度快，应用广泛等特点。,二、 高效液相色谱仪与应用,高效液相色谱仪的结构由输液系统、进样器、色谱柱、检测器、组分收集和数