彗星电泳方法整理

Comet assay简介 单细胞凝胶电泳技术（Single cell gel electrophoresis, SCGE），又称彗星试验（Comet assay），是在核酸沉淀法（Nucleoid sedimentation）和晕圈分析（Holo assay）等检测技术基础上逐步发展起来的一种在单细胞水平检测有核细胞DNA断裂的新技术。它主要包括Olive等建立的测定DNA双链断裂的中性单细胞凝胶电泳技术和Singh等建立的测定DNA单链断裂的碱性单细胞凝胶电泳技术。此技术已经被广泛应用于放射生物学、DNA断裂与修复、毒理学、肿瘤治疗评价、细胞凋亡等领域的研究。是碱性单细胞凝胶电泳可以检测DNA链的断裂和碱不稳定点，请问碱不稳定点是不是DNA上的脱嘌呤/嘧啶位点呀？还有个问题就是彗星试验检测到的DNA断裂其实是DNA损伤与修复的共同作用的结果，而且DNA修复的一个重要方式就是核苷酸切除修复，因此DNA修复过程也会造成DNA链的断裂，所以彗星试验所反映的时间效应关系，可能并非与真实的DNA损伤有偏差，因为它无法鉴别修复过程中的DNA断裂。SCGE技术的原理：细胞核中的DNA为负超螺旋结构，而且很致密，通常DNA双链以组蛋白为核心，盘旋而形成核小体。一般情况下，偶然的DNA单链断裂对核酸分子双股结构的连续性影响不大，而且不易释放出来，但是，如果用去污剂破坏细胞膜和核膜，用高浓度盐提取组蛋白，DNA残留而形成类核。如果类核中的DNA有断裂，断裂点将引起DNA致密的超螺旋结构松散，在类核外形成一个DNA晕圈。将类核置于电场中电泳，DNA断片可从类核部位向阳极迁移，经荧光染色后，在阳极方向可见形似彗星的特征性图像，故称“彗星试验”。彗星尾部即为迁移出类核的DNA片段。此时彗星尾部有可能还与头部以单链或双链的形式相连。DNA损伤越严重，导致DNA超螺旋结构越松散，产生的断裂点越多，DNA片段越小，从而在彗星尾部出现的DNA断片越多，则慧尾的长度、面积和荧光强度越大。通过测量彗星尾部的长度、面积或荧光强度等指标，可以对DNA的损伤程度进行定量分析。随着SCGE技术的发展，可测量的指标也越来越多，而且更准确。目前，用于SCGE分析的指标主要分为四类，包括形状指标、距离指标、强度指标和矩类指标。其中形状指标有彗星细胞率；距离指标包括彗星尾长、彗星全长、彗星头部半径、尾部半径；强度指标包括头部DNA百分含量、尾部DNA百分含量、头部面积、尾部面积等；矩类指标包括尾矩、Olive尾矩等。依靠目镜测微尺人工测量彗星距离指标，主观性较强，人为误差较大，而且矩类指标更需要人工通过公式计算得出，使研究人员的工作量加大。因此，研究人员渴望开发出一种专用的彗星图像分析软件。近年来，各国研究机构纷纷推出各自的图像分析软件，这些分析软件可以快速提供一系列评价参数，如彗星总长、尾长、尾DNA含量、尾矩和Olive尾矩等，更好地客观定量DNA损伤。目前，用于彗星分析的软件包括英国Kinetic Imaging公司的Komet5.5、Perceptive Instruments公司的Comet Assay 、LAI公司的LACAAS、美国NIH的ImagJ、TriTek公司的CometScoreTM、印度原子能研究所的SCGE-Pro、奥地利癌症研究所开发的自动分析软件等。其中的部分软件可以到其相应网站下载，但最好与相应的彗星分析系统硬件设备配套使用，价格昂贵，提高了研究成本。新近研发的彗星分析软件（Comet Assay Software Project, CASP）很好地解决了这一问题，该软件可以在普通微机上运行，界面友好，使用方便，分析速度快，可以一次同时给出最多达13个指标，分析结果避免了人为误差，更加客观和准确，结果可以以.txt文件直接输出，SPSS等统计软件可以直接读取其输出结果，便于统计学分析，节省大量人力物力。中性电泳与碱性电泳在适合的实验条件范围内，没有损伤的细胞在中性或碱性条件都不可能做出尾巴。中性检测DNA双链断裂，碱性检测DNA单链断裂。根据实验设计的需要，可以选择不同的实验条件，也可以同时选择两种条件，结果进行对比。拿电离辐射来说，中性和碱性检测的敏感范围不同，碱性SCGE的敏感范围值偏低，如可以小到0.05Gy，而中性SCGE的敏感范围值偏高，它可能检测不到0.05Gy的DNA损伤，但可以检测大到100Gy的损伤，而相对中性SCGE来说，碱性SCGE在大剂量照射时的各项指标容易形成平台。从修复方面来说，双链断裂的修复较单链断裂的修复慢，损伤重，后果更严重，双链断裂是后来形成染色体畸变和微核的主要物质基础。从文献上来看，药物引起的DNA损伤多采用碱性SCGE 检测单链断裂，A：碱性电泳是在1988年建立的，而最开始彗星方法都是在中性条件下做的（1984），所以我认为，这是方法逐步改进的过程。碱性条件下，DNA解旋，检测出来的应该是双链和单链断裂的综合损伤，这样可以提高试验的灵敏度，也就是您说的可以检测到0.05Gy,而中性电泳做不到这一点。B：中性条件跑出来的是DNA的双链，单链断裂不会出来，而强碱性条件下，破坏了断裂部位连接碱基的氢键，这样，双链断裂也就成了单链形式，可以说碱性检测的是“双链和单链断裂的综合损伤”，两种电泳条件的最大区别是适用于不同的实验需求。碱性条件的SCGE的建立也是为了满足不同实验需要。实践中要根据DNA致伤因素选择实验条件，如：电离辐射对DNA的损伤以双链断裂为主，应该选择中性SCGE，而且可以排除环境因素对DNA损伤的影响（因为DNA很容易受到环境因素的影响而断裂单链为主），如果用碱性的话，就不能区分哪些是实验因素引起的断裂，哪些是其它影响因素引起的断裂。如果实验致伤因素是以DNA单链为主，那就应该选择碱性SCGE了。有一点需要说明一下，碱性SCGE确实增加了检测的敏感性（中性SCGE达不到），但牺牲了特异性，DNA很容易受许多因素的影响而产生断裂，如吸烟、饮酒等不良生活习惯、环境污染等因素。所以碱性条件很难从实验结果中剔除哪些是非实验致伤因素造成的，对实验结果会或多或少有点影响。所以说SCGE条件的选择主要还要根据实验的需要来定。中/碱性单细胞凝胶电泳Unwinding of the DNA and electrophoresis at neutral pH (7-8) predominantly facilitates the detection of double strand breaks and cross links; unwinding and electrophoresis at pH 12.1-12.4 facilitates the detection of single and double strand breaks, incomplete excision repair sites and cross links; while unwinding and electrophoresis at a pH greater than 12.6 expresses alkali labile sites (ALS) in addition to all types of lesions listed above (Miyamae et al., 1997).Lysis and electrophoresis can be performed in alkaline (option A) or neutral (option B) conditions.Use option A to detect the combination of DNA single-strand breaks, double-strand breaks and alkali-labile sites in the DNA, and option B to detect only DNA double-strand breaks.一玻片处理1.将玻片放入肥皂或洗衣粉水中煮沸20 分钟。2.用热水将肥皂等污物洗去，再用自来水反复冲洗，最后再用蒸馏水冲洗3 5 次。必要时再置95 乙醇中浸泡1 小时，然后擦干或烘干备用。 新玻片常有游离碱质，因此应用清洁液或10 盐酸浸泡24 小时，然后分别用自来水及蒸馏水彻底洗涤。3. 用无水乙醇提前浸泡磨砂载玻片和盖玻片，至少过夜（用前最好预热下），再使用，可减少脱胶的问题。4. Label slide on frosted end using a pencil, not a pen.二至四步均应在暗处进行，以避免额外的DNA损伤performed under dim yellow lights to prevent DNA damage the premise is that usual lighting will cause DNA damage but have no data to support this concern.先准备裂解液，加应用液组分溶解至清澈后放冰箱！二胶的配制与铺设铺胶后都要加盖片（可不加），目的是使胶平整，凝胶固化后移去盖片，再铺另一层，普通波片表面比较光滑，容易脱胶，文献多用毛玻璃片，应该好一点，但也不能完全避免脱胶。表1.Sample preparation buffer(for plant tissue sliced with a fresh razor blade) pH7.4终浓度组分100mL200mL160mMNaCl0.9g1.8g8mM（25）Na2HPO4A：4mLA：8mL4mM（50）NaH2PO4B：2mLB：4mL50mMNa2EDTA.2H2O1.9g3.8g配胶用PBS（0.1M pH7.4）用PBS母液配制表2.制片用胶10mL100mL保存NMPA（0.75%）0.75g干燥，除湿LMPA（0.75%）0.075gLMPA75uL+样品25 uL，终浓度0.5%LMPA50uL+样品50 uL，终浓度0.5%4保存，37-42操作LMPA（0. 5%）0.05g4保存，37-42操作第一层：0.75正常熔点胶，100l，置于室温5min使其固化在烧杯里配100ml左右的正常熔点琼脂糖，煮沸之后把玻片放进去，让胶液浸过1/3之后，捞出玻片，用布或者别的什么把一面擦干，然后把玻片水平放置，晾干。*The slides may be air dried or warmed for quicker drying. Store the slides at room temperature until needed; avoid high humidity（湿） conditions. We generally prepare slides the day before use. *M. Klaude, S. Eriksson, J. Nygren, and G. Ahnstrom (1996) The comet assay: mechanisms and technical considerations. Mutation Res. 363: 89-96.第二层：0.75低熔点胶，75l +25l样品悬液，置于4固化1min（也可以把第二层胶配成1，然后把细胞和胶按照1：1的比例配，这样细胞多了，终浓度也是0.5%）附：三层胶法：Gently slide off coverslip and add a third agarose layer (75 L LMPA) to the slide. Replace coverslip and return to the slide tray until the agarose layer hardens (3 to 5 minutes). Remove coverslip.凝胶不要提前配置，可以提前称量好，分装，用前加PBS至5ml，反复用，效果不好，不易铺平，铺胶前低熔点胶PBS溶解、煮沸，要温于37度水浴箱，再和细胞混合（低熔点琼脂糖在恒温放久了，铺胶染色后会容易造成背景很脏），不会破坏细胞。关于脱胶问题，有几点需要注意：0.If the gels are not sticking to the slides properly, avoiding humidity and/or increasing the concentration of NMA agarose in the lower layer to 1.5% should eliminate the problem.1.第一层凝胶在经过裂解、解旋及电泳步骤后早就已经恢复了凝胶状态，与光滑玻片的粘合肯定不如以前紧密，因此在电泳及中和后更要轻夹轻放，玻片最好水平地取出，千万不能晃荡，要不然水的力量很容易把凝胶拖歪甚至全部扯下。2.中和液不要太多，能浸过玻片就可以了，液体太多浮力就大，凝胶容易漂起来。3.中和的时间不能过长，一般5分钟就可以了，时间长了也容易掉胶。4.中和的次数：只中和一次。一般文献上写三次，是因为电泳液中的强碱颗粒会附着在磨砂玻片的粗颗粒上，如果不中和干净的话很容易被EB染色。如果使用普通透明玻片的话就不会有这样的问题，一般染色后的背景都很均匀干净。三裂解Place slides back to back vertically in a 50 mL coplin jar containing 40 mL of cold Lysing Solution. Place the coplin jars in the refrigerator for a minimum of 1 hour.In our experience, slides may be stored for at least 4 weeks in cold Lysing Solution without affecting the results.15表3.中性裂解液终浓度组分990mL2.5MNaCl146.1 g30mMNa2EDTA.2H2O11.2 g10mMTris1.2 g溶解完全后调节pH至8，储备液室温保存应用液：99毫升，使用前加1%TritonX-100(1ml)表4.碱性裂解液终浓度组分990mL2.5MNaCl146.1 g100mMNa2EDTA.2H2O37.2 g10mMTris1.2 g加8克NaOH，溶解后调pH 10，应用液：99毫升，使用前加1%TritonX-100(1ml)将微电泳槽置于新鲜配制的裂解液中，4冰箱中裂解1.5-2h（时间可变），裂解时间短可能导致彗星头尾没有分离。如果裂解不彻底，最后电泳的时候DNA还被核膜包裹着，断裂的片断就分不开了，而且裂解液的配方也非常重要。在配置裂解液的时候一定要药品充分溶解，从冰箱里拿出裂解液的时候，也许会有一些结晶的东西，一定要加热到透明才可以。Lysing Solution裂解液配方（使用前在4 C预冷）：中性：2.5M NaCl 146.1 g30mM Na2EDTA.2H2O 11.2 g10mM Tris 1.2 gPH=7-8.0 （pH值要调得比较准确才行）1% N-Sodium Lauroyl Sarcosinate(肌氨酸钠)(可不加), 用去离子水定容至890ml（植物组织不用加10%10mlDMSO，定容到990ml）。过滤除菌，为贮备液，室温保存。应用液：89毫升，用前加1%TritonX-100(1ml), 10%10mlDMSO* Olive PL, Banth JP.Detection of DNA double-strand breaks through the cell cycle after exposure to X-rays, bleomycin, etoposide and 125IdUrd. Int J Radiat Biol. 1993 Oct;64(4):349-58.中的配方：30mM Na2EDTA.2H2O0.5% SDS, pH 8.0碱性：2.5M NaCl 146.1 g100mM Na2EDTA.2H2O 37.2 g10mM Tris 1.2 g加700ml水，用约8克NaOH，大约20分钟后溶解完全，调节pH至10。用去离子水定容至890ml（植物组织不用加10%10mlDMSO，定容到990ml）。过滤除菌，为贮备液，室温保存。应用液：89毫升，用前加1%TritonX-100(1ml), 10%10mlDMSO（消除血液或动物组织中血红蛋白释放的铁产生的自由基），使用前置冰箱至少30min。The purpose of the DMSO in the lysing solution is to scavenge radicals generated by the iron released from hemoglobin when blood or animal tissues are used. It is not needed for other situations or where the slides will be kept in lysing for a brief time only. Sodium lauryl sarcosinate, which we used earlier, is not included in this version, but may be needed for some cell types.肌氨酸钠破坏细胞膜的磷脂双分子层，有部分文献报道中没提到裂解液中加SLS的，加的话有助于对细胞膜的破坏，只是配裂解液时不好溶。第四届彗星分析研讨会讨论了SCGE的方法问题，【the 4th International Comet Assay Workshop (Ulm, Germany,2225 July 2001) 】专家组认为加肌氨酸钠是多余的。（The addition of 1% N-lauroylsarcosine is now considered redundant. ）裂解液时间长了会结晶，（浓度太高了），是不宜久存的，每次做的时候都要最先配制，而且用加热磁力搅拌器不停搅拌，同时就可以干别的，完全溶解后再放入冰箱预冷。 裂解液中，最难溶解的是SLS,它在中性的时候不易溶于水，所以你把其他的药品加进去后，先不要加SLS，这里需要磁力搅拌器搅拌，但是时间不会很长。溶解后，用NaoH把PH调到10，这里调PH值要用NaoH固体，然后把SLS加进去，在用磁力搅拌器搅拌，一般需要加热，50度左右就可以了。大约搅拌1个小时就可以溶解。这时，溶液应该是透明的，不是乳白色的。加热溶解的过程中，可能会损失一定的水分，等搅拌完了后，要把溶液的量补充到你最后需要的体积。从冰箱中取出裂解液后，裂解液如果有沉淀，就把它放在37度水浴中让它充分溶解，然后把DMSO和TritonX-100加进去，这时，还是乳白色的，放在37度中放一会就可以了。注意，溶液的颜色是透明清亮的，浑浊的话，不能起到裂解的效果，最后跑不出彗星来。四解旋与电泳取出载玻片，用双蒸水漂洗去掉多余的去垢剂和盐分（2-35min），置于提前加入1TBE电泳液的水平电泳仪中4 C解旋15min（10-30min），使原来致密的DNA双螺旋结构充分松解；20V, 200mA电泳20分钟，通过调节液面来调电压。电泳电压是根据电泳槽两极间的距离与电场强度（0.8-1.0V/cm）的乘积设定的。Different gel boxes will require different voltage settings to correct for the distance between the anode and the cathode.电压先调到最大，电流200mA，然后通过液面来调节电压Turn on power supply to 25 volts (0.74 V/cm) and adjust the current to 300 milliamperes by raising or lowering the buffer level. Depending on the purpose of the study and on the extent of migration in control samples, electrophorese the slides for 10 to 40 minutes.Electrophoresis Buffer电泳液配方（使用前在4 C预冷）：表5.中性解旋与电泳液（10）pH 8.5 终浓度组分1L900mMTris109g900mMH2BO355.6g20mMNa2EDTA.2H2O7.4g用时稀释成1表6.碱性解旋与电泳液（10）pH 13 终浓度组分200 mL500mL10 NNaOH200 g200 mMNa2EDTA14.89 g应用液：30mL NaOH+5mL EDTA定容至1L室温保存，两星期内用完！五中和切断电源，取出玻片，把玻片放在一个装有双蒸水的盒子里浸一下，洗掉多余的电泳液，然后把玻片捞起来竖放到吸水纸上吸干多余的水分，置染缸，中和缓冲液浸洗，35min（建议15min，防脱胶）。中和是为染色做准备的，中和后容易着色。Neutralization Buffer中和缓冲液配方（使用前在4 C预冷）stored for up to one year：表7.中和液（碱性电泳用）pH 7.5终浓度组分1L0.4 MTris48.5 g 加水800ml，HCl调pH至7.5定容至1000ml，室温可放置1年用时稀释成1有人中和后还要用76和96的乙醇处理，这一步的作用是脱水固定，固定后胶放置一段时间后也可以看，最好电泳后立即看的片子，以免影响图像质量。但是如果需要脱水的话就只能选择透明底的玻片，因为磨毛玻片表面不平，在酒精脱水后凝胶干燥形成颗粒，会被EB染色而严重影响读片质量。Drain slides, expose them (e.g., 5 min) to cold 100% ethanol or cold 100% methanol, and allow to dry. Store in dry area.If storing for more than 23 d,dip slides in ethanol and dry them. Dried slides can be stored for several months, but before analysis, rehydrate by adding a thin layer of agarose to reduce background fluorescence, and restain with propidium iodide.六染色和观察Slides can be stored in humidified, light tight boxes in the cold room (at 4 C).注意要保湿，可以放在平皿里，皿底部铺纱布，滴点蒸馏水即可，2.5g/ml溴化乙锭（EB）染色，（染色是不用枪的，用1毫升的一次性注射器，操作比较简单），染色后直接把片子放到专用的小染缸中洗涤，去掉多余染液，然后滤纸吸去多余水分，这样背景会处理的很干净，在荧光显微镜下(激发波长515-560nm，绿光)观察。未受损细胞表现为以圆形荧光核心，即彗星头部，没有尾巴。受损细胞则有彗尾伸向阳极，形成一个亮的头部和尾部。一般用20倍或者40倍放大就可以了。40倍效果更好一些，细胞比较好看。放大40倍的时候，一个视野下有410个细胞就行了。染色后的杂质问题主要有两个可能：1、标本不干净，来自离心管等；2、染色液过多，结晶，背景很亮，影响图像质量。染料选择：SYBR Green 是结合双链的内嵌染色剂，而碱性电泳是把DNA双螺旋解开成单链的，SYBR Green 用于检测双链，DAPI的敏感性比EB要好一点，也可以用，不过也是强致癌物。Staining Solution1.Ethidium Bromide (10X Stock - 20 g/mL): add 10 mg in 50 mL dH2O, store at room temperature. For 1X stock：mix 1 mL with 9 mL dH2O.SYBRTM Green/ Gold: Add 1 L of provided stock solution to 10 mL of TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) or TBE buffer (89 mM Tris base,89 mM boric acid, 1 mM EDTA, pH 8.0) to prepare a 1:10,000 dilution. Make fresh prior to use. Staining solution is stable for several hours at room temperature and for 1-2 days when refrigerated.表8.TBE buffer for dilution of SYBRTM Green/ Gold pH8.0 终浓度组分100mL89mMTris1.07g89mMH2BO30.55g1mMNa2EDTA.2H2O0.037g2.Propidium Iodide2.5g/mL of propidium iodide in distilled water for 20 min3.YOYO-1Stock solution of YOYO is 1 mM (Molecular Probe, Eugene, OR).Working solution has 0.25 M YOYO-1 in 2.5% DMSO and 0.5 % sucrose. Take 1L of YOYO-1 and add to 4 ml of distlled water. Then add 200L of the DMSO sucrose solution mentioned below. Working staining slutiion can be dispensed in 500L aliquotes and stored at -20 degrees 4.Hoescht 332585.DAPI 6.Acridine Orange*Arabidopsis Ribonucleotide Reductases Are Critical for Cell Cycle Progression, DNA Damage Repair, and Plant DevelopmentThe Comet Assay kit from Trevigen (Gaithersburg,MD) was used with minor modifications. Seedlings were chopped with a razor in a Petri dish kept on ice and containing 500 mL of 1 PBS plus 20 mM EDTA. The resulting mixture was filtered through a 60 mm nylon mesh. 40 ml of nuclei was mixed with 400 mL of 1% low-melting-point agarose (prewarmed at 37) and placed onto Trevigen-precoated slides. After incubating in lysis solution (2.5 M NaCl, 100 mMEDTA, pH 10, 10mMTris, 1% sodium lauryl sarcosinate, and 1%Triton X-100) for 1 h at 4, the nuclei on slides were unwound in alkaline solution (0.3 N NaOH and 5 mM EDTA) for 40 min and neutralized two to three times in 1 TBE (Tris-borate/EDTA) for 5 min. The slides were run at 1 V/cm for 10 min in 1 TBE and then dipped in 70% ethanol for 5 min. After air-drying, the slides were stained with a 1:10,000 dilution of SYBR green. Antifade solution (1% p-phenylenediamine dihydrochloride in 0.1 PBS and 90% glycerol) was added to slides that were examined by epifluorescence microscopy. The percentage of DNA in each comet tail (T DNA%) was evaluated with the Comet Score software () and assigned a number (0 to 4), with a higher number corresponding to a higher T DNA% (Collins et al., 1997). DNA damage units for each genotype were derived by averaging the data from four slides. One hundred comets were scored per slide.*DNA damage and repair in Arabidopsis thaliana as measured by the comet assay after treatment with different classes of genotoxinsAbout 75150 mg of the plant material were harvested, Briefly rinsed in GM, carefully dried with a paper towel and then immediately used for the comet assay or frozen in liquid nitrogen and stored at 80. Freezing and storing did not significantly influence the extent of DNA migration. The comet assay was performed in a darkroom with dim red light. Microscopic slides were precoated with a layer of 1%(0.75%) normal melting point agarose and thoroughly dried at 60. The seedlings were sliced in 300-400 ml PBS (160mM NaCl, 8mM Na2HPO4, 4mM NaH2PO4,pH 7.0) containing 50mM EDTA on ice with a fresh razor blade. Two drops of 30ml of the resulting suspension of nuclei were dropped separately on each slide, mixed with the same volume of liquid 1% low melting point agarose (Gibco BRL, Gaithersburg, USA) at 42 and covered with a 22mm 22mm coverglass. Nuclei were then subjected to unwinding in high salt (2.5M NaCl2, 10mM Tris-HCl, pH 7.5, 100(30)mM EDTA) containing 1% EDTA TtitonX-100 for 20 min (N/N protocol) at room temperature. Equilibration for 3 5 min in 1 TBE (90mM Trisborate, 2mM EDTA, pH 8.4) buffer on ice was followed by electrophoresis at room temperature in the same buffer for 6 min (N/N protocol) at 31V (1 V/cm), 1517 mA. *Comet assay in higher plants Tom GichnerIsolation of nuclei from leavesThe plant cell has a wall that cannot be removed as the animal cell membrane by lysis in high concentrations of detergents and salts, and so the nuclei have to be isolated mechanically. It is exceedingly important to gently isolate the nuclei from the leaves. All operations are conducted under dim or yellow light.(1) A small part of the leaf (about 2 x 1 cm are placed in a 60 mm plastic Petri dish. Onto each leaf 200 to 300 l of cold 0.4 M Tris buffer is spread.(2) Using a fresh razor blade, the leaf is sliced into a fringe. The Petri dish is kept tilted in the ice so that the nuclei would collect in the buffer.0.4 M Tris bufferDissolve 9.7 g Tris (Sigma USA, T-1378) in 180 ml dH2O, set pH to 7.5 with concentrated hydrochloric acid, add dH2O to 200ml, store at room temperature.Step of Comet Assay1. 低熔点胶在沸水浴中溶化后移至42水浴锅（准备多一倍备用）；铺好第一层胶的载玻片置于Block Heater上（每个样5片）；2. 打冰三盒，将干净玻璃培养皿放