串联亲和层析应用进展

第25卷 第6期 2013年6月 生命科学 Chinese Bulletin of Life Sciences Vol 25 No 6 Jun 2013 文章编号 1004 0374 2013 06 0632 07 串联亲和纯化技术及其在植物蛋白质组研究中的应用 王丰青1 吴为人2 陈新建1 李 娟1 周 艳1 张重义1 2 1 河南农业大学农学院 郑州 450002 2 福建农林大学作物科学学院 福州 350002 摘 要 串联亲和纯化 TAP 是一项新颖的蛋白质复合物纯化技术 已被广泛应用于鉴定或验证蛋白质间 的相互作用以及建立蛋白质互作网络 其基本原理是 将 TAP 标签融合到目标蛋白上 然后经过两步亲和 纯化 获得融合蛋白及其结构关联蛋白 TAP 技术最初主要在动物和微生物中应用 近几年来 随着新型 标签的出现和方法的改进 TAP 技术在植物中的应用逐渐增多 为植物蛋白质组学的研究提供了一个有效 的手段 简要介绍 TAP 方法在植物中的应用情况 并对 TAP 方法应用的限制因素进行分析 关键词 串联亲和纯化 标签 植物 蛋白质组 中图分类号 Q94 336 文献标志码 A Tandem affinity purification technology and its applications in plant proteomic research WANG Feng Qing1 WU Wei Ren2 CHEN Xin Jian1 LI Juan1 ZHOU Yan1 ZHANG Zhong Yi1 2 1 Agronomy College of Henan Agricultural University Zhengzhou 450002 China 2 College of Crop Science Fujian Agriculture and Forestry University Fuzhou 350002 China Abstract Tandem affi nity purifi cation TAP is a novel technology for protein complex purifi cation which has been extensively utilized for the identifi cation or verifi cation of protein protein interactions and the construction of protein interaction networks Its basic principle is that the TAP tag is fused to the target protein of interest and then the TAP tagged protein together with any associated proteins are isolated from the host organism in two sequential affi nity purifi cation steps Initially TAP technology was mainly used in animals and microbes But in recent years more and more applications of TAP technology in plants have been reported with the emergence of new TAP tags and optimized methods providing an efficient tool for plant proteomics This paper briefly introduced the application of the TAP method on plants and analyzed limiting factors in its application Key words tandem affi nity purifi cation tag plant proteomic 收稿日期 2012 12 30 修回日期 2013 02 22 基金项目 国家自然科学基金项目 81274022 30973875 河南农业大学博士科研启动基金 30500509 通信作者 E mail hauzzy Tel 0591 83742793 许多生命过程都受到蛋白质复合物的调控 研 究蛋白质复合物的组成和功能对阐明生命过程至关 重要 为此 首先必须对蛋白质复合物进行分离和 鉴定 1 在过去 20 多年中 已发展出很多研究蛋 白质互作的方法 其中免疫共沉淀技术和酵母双杂 交技术最为常用 近年来 由于超敏感 高通量的 质谱技术的发展以及蛋白质序列数据的快速增长 促进了原位分析蛋白质复合物的方法的发展 其中 串联亲和纯化 tandem affi nity purifi cation TAP 与 质谱相结合的蛋白质鉴定技术是研究蛋白质互作的 一种强有力的工具 1999 年 TAP 方法最先在酵母 中应用成功 2 由于它具有对蛋白质分离纯化效率 高 保持蛋白质复合物完整性等优点 在多个物种 中得到应用 促进了蛋白质互作网络的研究 3 6 但在植物中 TAP 方法的研究还相对滞后 迄今有 关 TAP 方法应用于植物蛋白组学研究的文献报道相 对较少 随着 TAP 方法的不断完善 它正逐渐成为 王丰青 等 串联亲和纯化技术及其在植物蛋白质组研究中的应用第6期 633 植物蛋白质组学研究的一个有效手段 1 TAP的方法原理 1 1 标签的种类和发展 TAP 方法是利用亲和层析的原理对目标蛋白进 行纯化的 传统的 TAP 标签由一个来自金黄色葡萄 球菌 Staphylococcus aureus 蛋白 A ProtA 的免疫 球蛋白 G immunoglobulin G IgG 结合单元和一个 钙调素结合肽 calmodulin binding peptide CBP 结 构域组成 在它们之间还有一个烟草蚀纹病毒 tobacco etch virus TEV 蛋白酶剪切位点 2 7 新型 的 TAP 标签则以来自链球菌 Streptococcus sp 蛋 白 G ProtG 的 IgG 结合单元和链霉亲和素结合肽 streptavidin binding peptide SBP 分别代替传统标 签中 ProtA 的 IgG 结合单元和 CBP 根据标签融合 到目标蛋白的位置 可分为 N 端标签和 C 端标签 两种 两者串联方向相反 图 1 标签 alternative TAP tag TAPa 其中 CBP 被 9 聚 myc 抗原表位 9 myc 和 6 聚组氨酸 6 His 序列 所取代 TEV 蛋白酶切位点被人鼻病毒 3C human rhinovirus 3C 蛋白酶剪切位点所取代 使标签的专 一性及其在低温下的活性得到增强 Goldfi nger等 11 则在 ProtA 的 N 末端连入一段 6 His 以便于纯化 B rckst mmer 等 8 用两个具有更广泛亲和性的链 球菌 ProtG 的 IgG 结合单元替代了传统标签中的 ProtA 的 IgG 结合单元 提高了蛋白质结合率 用 洗脱效率更高的 SBP 取代了传统标签中的 CBP 提高了蛋白质洗脱效率 这种 GS TAP 标签可使 TAP 方法在产率上提高 10 倍 Gian none 等 12 在前 人研究的基础上又设计了 5 种新型标签 他们用亲 和力更强 而且相对分子质量更小的 Strep Tactin 结合肽 StrepII 替换 SBP 引入两个 TEV 蛋白酶 切位点以提高酶切效率 并设计了一个含 4 个半胱 氨酸的蛋白质序列 CCPGCC 以便运用荧光标记 方法检测诱饵蛋白的表达 提纯和定位 也有研究 人员利用植物自身蛋白质的结合域构建新的 TAP 标 签 如 Qi 和 Katagiri 13 构建了包含一个拟南芥 MCCA At1g03090 C 端 80 个氨基酸序列和 HA 抗 原 以及中间含 PreScissionTM 蛋白酶酶切位点的 HPB 标签 业已开发的标签种类很多 但并非都适合于植 物的蛋白质纯化 而且不同的植物材料及不同的蛋 白质类型适用的标签可能也不一样 通常 研究者 会根据自己的实验要求 通过评估不同标签的纯化 效果 选择最佳的标签 或对已有标签进行改良 Van Leene 等 14 比较了不同的标签分离纯化拟南芥 蛋白质复合物的效果 发现以 StrepII 和 3 聚 Flag 3 Flag 替代传统标签中 CBP 的 SFZZ tag 标签背 景较清晰 但纯化的蛋白质复合物的量较低 仅能 鉴定较少的互作蛋白 而传统的 TAP 标签或者 TAPi 标签 虽然会混入一些背景蛋白质 但是纯 化的蛋白质复合物量多 效果最好的是 GS TAP 标 签 不仅比传统标签获得更多的蛋白质复合物 而 且特异性更强 1 2 串联亲和纯化 串联亲和纯化方法与其他融合标签纯化方法的 最大不同是 它选用了两个连续的标签 如传统的 TAP标签中的ProtA和CBP 而不是通常的一个 15 最初用于酵母蛋白质复合物鉴定的 TAP 方法 2 具 有很广的通用性 不但能够用于酵母蛋白质网络的 研究 而且还可用于哺乳动物细胞和植物悬浮细胞 图1 新型N端和C端标签结构 8 Rigaut 等 2 对不同的标签进行检测 发现仅有 ProtA 和 CBP 标签能够在以融合蛋白的形式低浓度 地存在于蛋白质复合物中的情况下获得有效的回收 回收率分别约为 80 和 50 最初 该类标签 在研究酵母和原核生物蛋白质复合物中得到了广泛 的应用 如 Gavin 等 5 首次利用串联亲和方法在全 基因组范围内对一个物种的蛋白质复合物进行研 究 鉴 定 出 36 000 个 酿 酒 酵 母 Saccharomyces cerevisiae 的蛋白质 分属于 491 个蛋白质复合物 其中 257 个是新发现的 Butland 等 9 利用 857 个 被标签上的大肠杆菌蛋白 绘制了首张大肠杆菌蛋 白质相互作用的网络图谱 为了更好地应用串联亲和纯化技术分析植物蛋 白质复合物 Rohila 等 7 对 TAP 标签进行了遗传 密码子偏好性的改良 并通过突变删除了 CBP 中 的核定位序列 nuclear localization signal NLS 这 种改良的 TAP 标签 improved TAP tag TAPi 对融 合蛋白在植物体内的生物功能影响更小 具有更大 的应用范围 Rubio 等 10 发展了一种替代型 TAP 生命科学第25卷 634 蛋白质复合物的分析 1 但不同物种应用的纯化方 法有一定的差异 如与最初用于酵母的方法相比 用于植物悬浮细胞的方法有三个方面的不同 一是 在两次亲和柱上的孵育时间都要缩短 二是所有的 缓冲液都要添加蛋白酶抑制剂 三是在钙调素亲和 蛋白洗脱过程中须提高 EGTA 的浓度 1 传统的 TAP 都是两步法 随着技术的改进 采用一步法也获得了较理想的结果 如 GS TAP 标 签既可采用传统的两步法 图 2A 进行纯化 也可 以用一步法 图 2B 进行纯化 8 这是因为 GS TAP 标签可以高效纯化生物体内含量较低的蛋白质 复合物 并且与传统的酵母 TAP 方法相比 纯化同 样量的蛋白质所需的生物材料较少 另外 在最后 一步洗脱时 用生物素代替 SDS 缓冲液 增加了 洗脱的特异性 HPB TAP 标签也可采用一步法进 行纯化 因为它利用的是链霉亲和素与生物素之间 的互作 不仅可以获得足够高的蛋白质纯度 而且 能得到比传统TAP纯化程序更多的蛋白质 13 因此 利用这两种标签 以同样的裂解物为材料 实验人 员可以根据蛋白质复合物的状态和实验的需要选择 不同的纯化方法 与其他亲和纯化方法相比 TAP 方法在研究蛋 白质复合物及其相互作用方面有很多优点 第一 在未知功能和结构的前提下 TAP 方法可以快速纯 化蛋白质复合物 第二 TAP 方法可以在原位对蛋 白质复合物进行分离纯化 能够保证蛋白质结构的 完整性 14 第三 所有的蛋白质纯化可以在同样的 条件下进行 保证了实验结果的可重复性和可比较 性 由于这些优点 TAP 方法在原核生物和真核生 物的蛋白质组学研究方面得到了广泛的应用 2 TAP在植物蛋白质组学中的应用 TAP 方法在蛋白质相互作用方面的研究中主要 用于 1 鉴定新的蛋白质复合物 2 鉴定蛋白质 复合物中的新组分 3 鉴定目标蛋白的互作蛋白 自 1999 年 Rigaut 等 2 最先报道用 TAP 方法分离和 鉴定蛋白质复合物以来 TAP 方法在大肠杆菌 Es che richia coli 16 18 果蝇 Drosophila melanogaster 19 21 和人 Homo sapiens 22 24 中相继有不少成功应用的 报道 但直到 2004 年才有用该技术分离植物蛋白质 复合物的文献 7 近年来 TAP 技术在植物蛋白质 组学方面的应用逐渐增多 已经成功应用于烟草 拟南芥 水稻等植物的蛋白质互作分析和蛋白质复 合物的分离 纯化和鉴定 2 1 验证已知功能蛋白的互作 TAP 在植物中最初的报道主要集中在验证已知 的蛋白质复合物个体间的互作关系 Rohila 等 7 最 先报道应用 TAPi 在瞬时表达系统中分离烟草叶片 交联蛋白质复合物 他们以 GVG 包含酵母转录因 A 两步法纯化 B 一步法纯化 GS TAP标签既可通过串联亲和方法 两步法 进行纯化 也可通过一步法进行纯化 在两 种纯化方法中 可用生物素代替SDS洗脱缓冲液煮沸 以增加洗脱的特异性 图2 利用GS TAP标签进行蛋白质复合物纯化的步骤 8 王丰青 等 串联亲和纯化技术及其在植物蛋白质组研究中的应用第6期 635 子 GAL4 的 DNA 结合结构域 疱疹病毒蛋白 VP16 的转录激活域和鼠糖皮质激素受体 GR 的受体结构 域 为目标蛋白 成功分离出 HSP70 和 HSP90 两 个互作蛋白 而 Rubio 等 10 应用稳定转化的转基 因体系表达 TAP 标签的蛋白质进行蛋白质复合物纯 化在拟南芥中最先获得成功 他们应用替代型串联 亲和纯化标签 TAPa 以多蛋白质复合物 COP9 signalosome CSN 的一个亚基 CSN3 为目标蛋白 验证已知的蛋白质复合物 CSN 的组分 已知 CSN 复合物包括 8 个亚基 CSN1 8 相对分子质量从 5 7 104 CSN1 到 2 2 104 CSN8 其组分 结构 和活性都已非常清楚 25 26 Rubio 等把 CSN3 TAPa 导入到突变体背景 CSN3 TAPa csn3 csn3 成功分 离出了 CSN 的组分 SCF 型和 RING 型 E3 连接酶 组分 以及广感受器蛋白和少数几个形态发育正向 和负向调控因子 Sawa 等 27 利用 TAP 技术验证了 两个花期调控蛋白之间的互作 已知 CONSTANS CO 的表达调控是拟南芥光周期调节花期途径的主 要进程 28 29 FLAVIN BINDING KELCH REPEAT F BOX 1 FKF1 和 GIGANTEA GI 是 CO 的正调 控转录因子 30 酵母双杂交实验证实 FKF1 和 GI 之间存在直接的互作 他们利用蛋白血凝素 haemagglutinin HA 标签的 FKF1 和 TAP 标签的 GI 进行亲和纯化 结果在长日和短日条件下 HA FKF 与 GI TAP 蛋白均能共沉淀 说明两者在植物 体内也是存在互作的 2 2 鉴定新的蛋白质复合物和蛋白质互作 鉴定新的蛋白质复合物 分离已知蛋白质的互 作蛋白 进而阐明某种发育进程和信号途径的分子 机理 是蛋白质组学和功能基因组学的主要研究方 向 也是 TAP 技术的主要功能和优势所在 TAP 技术在研究细胞周期调节的分子机制方面 应用最早 Van Leene 等 1 以拟南芥周期蛋白为研 究目标 最先报道了应用 TAP 方法在植物上寻找新 的未知蛋白之间的相互作用 在拟南芥中 已经鉴 定了 100 多个关键细胞周期基因 至少 29 个 CDK 基因和 52 个细胞周期蛋白 cyclin 相关基因被鉴 定 31 32 但 CDK cyclin 复合物之间 复合物与底 物之间 复合物与其他分子之间的互作关系还知之 甚少 他们以拟南芥悬浮培养细胞为材料 利用改 良的亲和标签 N 端 TAPi 随机选取了 6 个细胞周 期蛋白为 TAP 标签目标蛋白 鉴定并证实了 42 个 蛋白质之间存在关联 其中 28 个关联是以前没有 发现的 后来 他们又利用 GS TAP 标签检测到 UVH6 ultraviolet hypersensitive 6 和一个已知与转 录因子 TFIIH 复合物关联的转录因子能够共纯化 表明 CDKD2 是 TFIIH 复合物的组成部分 Cromer 等 33 分别以细胞周期后期促进复合物 APC C anaphase promoting complex cyclosome 辅激活因子 CDH1的 3 个同源蛋白 CCS52A1 CCS52A2 CCS52B 和转录激活因子 CDC20 的 2 个同源蛋白 CDC20 1 CDC20 3 为诱饵蛋白 以 APC C 的抑制因子 OSD1 抗体对纯化产物分别进行检测 发现分别在 CDC20 1 和 3 个 CCS52 为诱饵蛋白的纯化产物中 检测到了 OSD1 说明 OSD1 和 CDC20 1 CCS52A1 CCS52A2 CCS52B 存 在 互 作 为 进 一 步 阐 明 OSD1 在拟南芥减数分裂过程中的分子机制提供了 重要的依据 Domenichini 等 34 应用 TAP 鉴定拟南 芥复制前复合物 pre RC 亚基CDT1 CDC10 Target1 两个亚型 CDT1a 和 CDT1b 的分子伴侣 分别以 CDT1a 和 CDT1b 为诱饵蛋白 均能纯化出 DNA 聚合酶 的两个亚基 DPB2 和 POL2A 酵母双杂交 证实 CDT1 确实能够与 DNA 聚合酶 互作 在植物激素信号转导的分子机制研究方面 也 较多地应用到了 TAP 技术 Pauwels 等 35 通过从 茉莉酸 JA 处理的拟南芥细胞悬浮物里分离出 JAZ1 TAP 标签的蛋白质复合物 获得 Groucho Tup1 型共抑制子 TOPLESS TPL 36 和 TPL 相关 蛋白 发现一个新的蛋白 命名为 NINJA novel interactor of JAZ 进一步分析证实 NINJA 作为 转录抑制子 其活性由一个功能性的 TPL 结合乙醇 响应元件结合因子关联的两性阻遏抑制基序所介 导 是茉莉酸响应的负调控蛋白 后来 Fern ndez Calvo 等 37 分别以 MYC2 MYC3 和 MYC4 为诱 饵 也都鉴定出了 NINJA 说明 NINJA 能够与 JAZ 抑制蛋白和 MYCs 形成复合物参与 JA 信号通 道 Antoni 等 38 应 用 GS TAP 标 签 的 ABA 受 体 PYRABACTIN RESISTANCE1 LIKE8 PYL8 为 诱 饵蛋白进行纯化分析 鉴定出 5 个 A 类 PP2Cs phosphatases type 2C 即 HAB1 HAB2 ABI1 ABI2和 PP2CA AHG3 从而证实 ABA受体 PYRABA CTIN RESISTANCE1 PYR PYL 能够与不同的 A 类 PP2Cs 互作形成不同的复合物调控拟南芥根系的 发育 Berckmans 等 39 应用酵母单杂交 Y1H 技 术发现生长素信号途径中一个重要的转录因子 LATERAL ORGAN BOUNDARY DOMAIN 18 LBD18 绑定在一个控制须根发育的转录因子基因 E2Fa 的启动子上 然而 LBD18 的瞬时过量表达 生命科学第25卷 636 不足以诱导启动子活性 暗示 LBD18 激活 E2Fa 的 转录可能需要一个辅因子 于是 他们以 LBD18 为诱饵蛋白 用 TAP 方法鉴定出 5 个互作蛋白 包 括另外一个 LBD 蛋白 LBD33 与单独瞬时表达 LBD18 和 LBD33 相比 两个基因共表达能够显著 激活 E2Fa 的启动子活性 这些结果说明 LBD18 与 LBD33 形成二聚体绑定到 E2Fa 启动子上 调控拟 南芥侧根的发育 TAP 技术在植物中也成功用于膜蛋白质复合物 的组分鉴定 Qi 和 Katagiri 13 利用新型的 HPB TAP标签 以拟南芥膜定位的R蛋白RPS2 resistance to P syringae 2 作为 HPB 诱饵蛋白 利用自身启动 子驱动融合蛋白的表达 鉴定出已知的 RPS2 互作 因子RIN4和其他8个PRS2复合物可能的组分蛋白 但多次重复实验所鉴定出的蛋白数量和种类不完全 一 致 说 明 RPS2 可 能 是 不 同 复 合 物 的 组 分 Bassard 等 40 应用 GS 标签 以两个可在内质网 ER 膜内和膜上移动的细胞色素 P450 蛋白 CYP73A5 CYP98A3 为诱饵蛋白 从不添加激素的 MSMO 培 养基洗涤过的悬浮细胞 诱导条件 和未洗涤的悬 浮细胞蛋白提取物里共分离出 16 个新的互作蛋白 其中多数是已知的 ER 膜蛋白 为阐明木质素合成 的分子途径奠定了基础 此外 TAP 技术也用于鉴定 14 3 3 蛋白质复 合体 Chang 等 41 以拟南芥 14 3 3 At1g78300 为诱饵蛋白进行 TAP 实验 发现它至少能与其 12 个亚型中的 10 个形成二聚物 并鉴定出 121 个与 其互作的蛋白 其中 80 以上是以前未报道的 14 3 3 互作因子 除了拟南芥以外 TAP 技术也成功用于水稻蛋 白质组学研究 Rohila 等 42 对植物胁迫信号途径 病原菌抗性识别 ABA 乙烯信号途径 新陈代谢 和细胞周期的调控等许多生理方面的关键因子 蛋白激酶进行了研究 以进一步理解蛋白激酶识别 底物和介导信号的特异性 他们研究了水稻 41 个 TAP 标签的蛋白激酶 发现 95 的蛋白激酶能够 被纯化出来 65 的蛋白激酶与其他水稻蛋白存在 互作 其中一些蛋白质互作关系与在其他物种中发 现的一致 通过比较分析已有的 129 个 TAP 标签的 水稻蛋白激酶 利用酵母双杂交的方法鉴定出 1 个 新的水稻蛋白与非常保守的细胞分化周期 CDC2 蛋 白质复合物互作 43 为了研究 OsGI 调控水稻花期 的分子机理 Abe 等 44 以 OsGI 为诱饵蛋白 应用 TAP 方法鉴定出 7 个与 OsGI 互作的蛋白质 与其 中 1 个蛋白 dynamin 的互作通过免疫共沉淀实验得 到了证实 3 存在的问题和解决途径 TAP 技术在酵母中成功应用迄今已超过 10 年 时间 但在植物中通过 TAP 技术可获得的蛋白质互 作数据仍然很少 这在一定程度上与纯化方法有很 大关系 14 综合前人的研究 以下几个方面在一定 程度上限制了 TAP 技术在植物蛋白质组学上的 应用 第一 外源标签蛋白与内源目标蛋白在形成蛋 白质复合物时存在竞争 使得可纯化的融合蛋白减 少 有两种方法可用来解决这个问题 一是把 TAP 标签的蛋白导入突变体背景下 其中的内源蛋白通 过 RNA 干扰 19 或 T DNA 插入得以消除 10 这样 将有更多的标签蛋白参与组成蛋白质复合物 因而 增加了纯化蛋白质复合物成功的几率 二是通过过 量表达标签的蛋白 增加与内源蛋白的竞争 目前 在植物中进行串联亲和纯化成功的报道多是利用这 种方法 第二 鉴定互作蛋白时易出现假阳性 尤其是 研究低丰度的蛋白质复合物时 细胞中蛋白质的数 量存在高度动态的范围 从每个细胞 10 100 个拷 贝到多于 107个拷贝 而且不能像核酸一样可以通 过 PCR 进行扩增 14 通常情况下 要纯化出可供 研究的蛋白质复合体 需要 5 108 1 109个细胞 而且必须是稳定转染并能够表达诱饵蛋白质的细 胞 植物体内多是高度分化的细胞 在这些细胞中 目标蛋白含量可能很低 尚未分化的细胞仅占较小 的一部分 而且主要集中在分生组织中 1 所以 提取大量能用于分析的功能蛋白难度很大 传统的 TAP 技术也很难纯化出足够量的蛋白质复合体 提 高蛋白质产率的一个有效途径就是选择合适的组织 材料 比如悬浮培养细胞 悬浮培养细胞是研究细 胞周期进程和外源生长物质对细胞生理影响的优质 材料 由于悬浮细胞可以迅速增殖 因而能够源源 不断提供分化过程中的细胞用于蛋白质提取 另外 对传统的 TAP 标签进行改造 提高纯化效率 也可 提高标签蛋白的产率 目前在植物中较成功地应用 主要是在拟南芥上 如 Van Leene 等 1 用 NTAPi 标 签 从悬浮培养细胞中分离了细胞周期蛋白复合物 Pauwels 等 35 利用 GS TAP 从悬浮培养细胞中分离 了茉莉酸甲脂信号途径蛋白质复合物 去掉非特异 性纯化蛋白可以通过设置对照 TAP 也可以通过多 王丰青 等 串联亲和纯化技术及其在植物蛋白质组研究中的应用第6期 637 次试验提高实验结果的可靠性 5 或者通过分析蛋 白质数据库 预测蛋白质互作 提高结果的准确性 14 第三 能够鉴定出蛋白质复合物的比例较低 Rubio 等 10 利用 7 个不同的拟南芥基因与 TAPa 标 签融合进行突变体表型互补分析 把转基因系与它 们的野生型和突变体种植在同样的环境下 发现只 有 2 个基因的转基因系能够完全恢复它们相应的突 变体表型 3 个转基因系能部分恢复突变体的表型 Rohila 等 43 以 48 个在水稻叶片中表达的蛋白质激 酶为目标蛋白 其中有 45 个能够获得纯化的产物 但只有 13 个表现出与其他蛋白质存在互作 这可 能与融合蛋白是否有功能有关 标签可能干扰了其 形成有功能的蛋白质复合物的能力 可通过同时构 建 N 端和 C 端标签的融合表达载体 或在目标蛋 白和标签间加入一段氨基酸序列 尽量降低标签对 目标蛋白功能的影响 相对长的纯化程序使稳定性 不强的蛋白质复合物不能被有效地纯化 因此 需 要改良纯化方法 从而更加迅速地获得低丰度的目 标蛋白质和它们的互作蛋白质 4 展望 在真核生物中 细胞分化由大量的基因控制 它们的表达受转录和转录后调控 了解蛋白质的功 能是后基因组时代生物学的一个主要目标 绘制蛋 白质相互作用图谱是系统研究各种生命现象的必由 之路 利用酵母双杂交和蛋白质芯片技术在全基因 组范围内研究蛋白质网络方面已经并且仍在发挥着 重要的作用 然而 这些技术只能提供双向互作的 信息 而且可能提供假阳性和假阴性的结果 这些 不足限制了它们在大规模蛋白质复合物纯化方面的 应用 45 近年来 随着高通量测序技术的应用 越 来越多的植物包括许多重要的药用植物的转录组信 息被揭示出来 46 48 获得了大量的差异表达基因 为植物生长发育 信号转导以及次生代谢途径的分 子调控机理研究奠定了基础 然而 由于非模式植 物缺乏足够的基因组信息 这些物种的蛋白质组学 研究在很大程度上受到限制 49 TAP 方法具有在未 知功能和结构的前提下快速纯化蛋白质复合物 在 生物体内生理条件下进行分离纯化 所有蛋白质复 合物纯化可以在同样的条件下进行等优点 因此 虽然目前这种方法还存在一些缺点和不足 但毫无 疑问 它将对植物蛋白质复合物的分离 蛋白质与 蛋白质互作的鉴定等方面发挥重要的作用 参 考 文 献 1 Van Leene J Stals H Eeckhout D et al A tandem affi nity purification based technology platform to study the cell cycle interactome in Arabidopsis thaliana Mol Cell Proteomics 2007 6 7 1226 38 2 Rigaut G Shevchenko A Rutz B et al A generic protein purifi cation method for protein complex characterization and proteome exploration Nat Biotechnol 1999 17 10 1030 2 3 Ho Y 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