药物分析-第十三章-3

概述,氨基糖苷类抗生素（aminoglycoside antibiotics）由碱性环己多元醇（苷元）与氨基糖缩合而成 中国药典主要收载有硫酸链霉素、阿米卡星、硫酸小诺霉素、硫酸巴龙霉素、硫酸卡那霉素、硫酸西索米星、硫酸阿米卡星、硫酸萘替米星、硫酸依替米星、硫酸庆大霉素、妥布霉素、硫酸核糖霉素、硫酸新霉素等。,一、结构与性质关系分析,二、鉴别试验,目录,三、特殊杂质检查,四、含量测定,【拓展提高】抗生素微生物检查法,一、结构与性质关系分析,常用药物结构,主要理化性质,常用药物结构,链霉素（streptomycin）,常用药物结构,庆大霉素（gentamycin）,常用药物结构,硫酸卡那霉素（kanamycin sulfate）,常用药物结构,阿米卡星（amikacin）,主要理化性质,1. 性状 2. 碱性 3. 溶解性 4. 糖苷键的稳定性 5. 旋光性,性状,均为白色或类白色粉末无臭或微臭味微苦有引湿性,返 回,碱性,结构中含有多个羟基和碱性基团，属于碱性、水溶性物质可与无机酸或有机酸成盐临床主要应用硫酸盐，如硫酸链霉素,返 回,溶解性,硫酸盐在水中易溶在乙醇、三氯甲烷等有机溶剂中几乎不溶,返 回,糖苷键的稳定性,糖苷键易于水解链霉素结构中具有双糖胺，氨基葡萄糖与链霉糖之间的苷键结合强，不易水解；链霉胍与链霉双糖胺间的苷键结合较弱，易于水解，故水解后生成一分子苷元和一分子双糖；水溶液在pH57.5最稳定，过酸和过碱易水解失效；庆大霉素较稳定，pH212时，100加热30分钟亦未变化,返 回,旋光性,结构中具有多个手性中心，具有旋光性,返 回,二、鉴别试验,（一）坂口（Sakaguchi ）反应,（二）麦芽酚（Maltol）反应,（三）茚三酮反应,（四）N-甲基葡萄糖胺（Elson-Morgan ）反应,（五）糠醛反应（Molish）,（六）硫酸盐鉴别反应,（七）色谱法,二、鉴别试验,（一）坂口（Sakaguchi）反应,坂口反应为链霉胍的特征反应 原理 反应式 药典方法,坂口反应原理,在碱性条件下，链霉素水解，生成链霉胍。链霉胍、8-羟基喹啉分别同次溴酸钠反应进一步相互作用后生成橙红色产物,返 回,坂口反应反应式,返 回,坂口反应实验方法,取本品约0.5mg，加水4ml溶解后，加氢氧化钠试液2.5ml与0.18-羟基喹啉的乙醇溶液1ml，放冷至约15，加次溴酸钠试液3滴，即显橙红色,返 回,二、鉴别试验,（二）麦芽酚（Maltol）反应,麦芽酚反应为链霉素特征反应 原理 反应式 药典方法,麦芽酚反应原理,在碱性条件下，链霉素水解生成链霉糖链霉糖经分子重排扩环为六元环，然后消除N-甲基葡萄糖胺和链霉胍，生成麦芽酚（-甲基-羟基-吡喃酮）Fe3可与麦芽酚在微酸性条件下生成紫红色配合物,返 回,麦芽酚反应反应式,返 回,麦芽酚反应实验方法,取本品约20mg，加水5ml溶解后，加氢氧化钠试液0.3ml，置水浴上加热5分钟，加硫酸铁铵溶液0.5ml，即显紫红色,返 回,二、鉴别试验,（三）茚三酮反应,氨基糖苷结构，具有特征的羟基胺和-氨基酸的性质，易与茚三酮试液反应，生成特征的蓝紫色产物 中国药典（2010年版）对硫酸小诺霉素、硫酸庆大霉素、硫酸核糖霉素的鉴别即采用茚三酮 原理 药典方法,茚三酮反应原理,返 回,茚三酮反应方法,取本品约5mg，加水1ml溶解后，加0.1茚三酮的水饱和正丁醇溶液1ml与吡啶0.5ml，水浴中加热5分钟，即显紫蓝色,返 回,二、鉴别试验,（四）N-甲基葡萄糖胺（Elson-Morgan）反应,氨基糖苷类药物在水解时，均会产生葡萄糖胺衍生物如庆大霉素产生N-甲基葡萄糖胺、硫酸新霉素产生D-葡萄糖胺 原理 药典方法,原理,葡萄糖胺衍生物在碱性条件下与乙酰丙酮缩合生成吡咯衍生物吡咯衍生物与对二甲氨基苯甲醛的酸性醇试剂（Ehrlich试剂）反应，生成特征樱桃红色产物,返 回,方法：示例硫酸新霉素的鉴别,取本品约10mg，加水1ml溶解后，加盐酸溶液（9100）2ml，在水浴中加热10分钟，加8氢氧化钠溶液2ml与2乙酰丙酮水溶液1ml，置水浴中加热5分钟，冷却后，加对二甲氨基苯甲醛试液1ml，即显樱桃红色,返 回,二、鉴别试验,（五）糠醛反应（Molish试验）,具有五碳糖或六碳糖的氨基糖苷类抗生素，在酸性条件下水解可脱水生成糠醛或羟甲基糠醛，与蒽酮试液反应呈色 阿米卡星、硫酸卡那霉素的鉴别 原理 药典方法,糠醛反应原理,糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮试液反应呈色,返 回,糠醛反应方法：示例-阿米卡星鉴别,取阿米卡星约10mg，加水1ml溶解后，加0.1蒽酮硫酸试液4ml，即显蓝紫色,返 回,二、鉴别试验,（六）硫酸盐鉴别反应,氨基糖苷类抗生素多与硫酸成盐可通过对硫酸根的鉴定来鉴别此类药品。如中国药典（2010年版）对硫酸小诺霉素、硫酸卡那霉素、硫酸巴龙霉素、硫酸庆大霉素等的鉴别,二、鉴别试验,（七）色谱法,采用薄层色谱法和高效液相色谱法如中国药典（2010年版）阿米卡星、小诺霉素、巴龙霉素、卡那霉素、庆大霉素等的鉴别采用了薄层色谱法或高效液相色谱法。,三、特殊杂质检查,（一）庆大霉素C组分的检查,（二）异常毒性,（三）溶液的澄清度与颜色,三、特殊杂质检查,（二）庆大霉素C组分的检查,庆大霉素C组分【相关链接】庆大霉素C组分的测定,庆大霉素C组分,庆大霉素是庆大霉素C组分的复合物，R1、R2、R3的不同决定其为不同的C组分 各厂家产品C组分含量比例不完全一致。庆大霉素Cl、C2、Cla、C2a活性无明显差异，但其毒副作用和耐药性有差异，从而影响产品的效价和临床疗效药典规定应控制各组分的相对含量百分比，采用高效液相色谱法,返 回,【相关链接】庆大霉素C组分的测定,色谱条件与系统适应性试验 测定法 计算公式,返 回,色谱条件与系统适应性试验,用十八烷基键合相硅胶为填充剂（pH值范围0.88.0）以0.2mol/L三氟醋酸-甲醇（928）为流动相；流速为每分钟0.6ml；用蒸发光检测器检测分别称取庆大霉素和小诺霉素标准品各适量，用流动相制成每1ml各含0.2mg的溶液，,色谱条件与系统适应性试验,取20l注入液相色谱仪，记录色谱图;C组分的出峰顺序从第二个主峰计，依次为庆大霉素C1a、C2、小诺霉素、C2a、C1;C2、小诺霉素和C2a峰之间的分离度应符合要求，连续进样的小诺霉素峰面积的相对标准差应不大于2.0。,返 回,测定法,取庆大霉素标准品适量，精密称定，分别用流动相制成每1ml中约含庆大霉素1.0mg、2.5mg和5.0mg的溶液作为标准溶液（1）、（2）、（3）。分取上述溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图;计算标准品溶液各组分浓度的对数值，与相应的峰面积对数值的回归方程，相关系数（r）应不小于0.99；,测定法,另取本品适量，用流动相制成每1ml约含庆大霉素2.5mg的溶液，同法测定用回归方程计算供试品中对应各组分的量（ ）并根据所得的各组分的量（ ）按公式计算各组分的含量。,返 回,计算公式,返 回,三、特殊杂质检查,（三）异常毒性,硫酸链霉素在药典中规定应检查异常毒性方法收载于药典附录XI C，采用小鼠死亡实验按规定剂量和给药途径将供试品给予小鼠，在规定的时间内观察小鼠的死亡情况，从而判定供试品是否符合规定,三、特殊杂质检查,（四）溶液的澄清度与颜色,氨基糖苷类抗生素规定应检查溶液的澄清度与颜色，目的是控制生产中引入的杂质、菌丝体、培养基、降解产物和色素等的限量。示例：硫酸庆大霉素的溶液澄清度与颜色检查,硫酸庆大霉素的溶液澄清度与颜色检查,取本品5份，各0.4g，分别加水5ml使溶解，溶液应澄清无色；如显混浊，与1号浊度标准液比较，均不得更浓；如显色，与黄色或黄绿色2号标准比色液比较，均不得更深。,返 回,四、含量测定,概 述,【实例分析】硫酸卡那霉素的含量测定,四、含量测定,概 述,中国药典（2010年版）对氨基糖苷类抗生素原料和制剂的含量测定，多数药物仍旧采用抗生素微生物检定法测定但对卡那霉素、阿米卡星、硫酸依替米星等的含量测定则采用了高效液相色谱法,四、含量测定,【实例分析】硫酸卡那霉素的含量测定,色谱条件与系统适应性试验 测定法,色谱条件与系统适应性试验,用十八烷基键合相硅胶为填充剂；以0.2mol/L三氟醋酸-甲醇（955）为流动相；用蒸发光散射检测器检测。分别称取卡那霉素对照品和卡那霉素B对照品各适量，用水溶解并制成每1ml各约含80g的混合溶液，,取20l注入液相色谱仪，记录色谱图卡那霉素峰与卡那霉素B峰的分离度应不小于5.0；计算5次进样结果，卡那霉素峰面积的相对标准差不得过2.0。,返 回,色谱条件与系统适应性试验,取卡那霉素对照品适量，精密称定，用水溶解并制成每1ml中约含卡那霉素0.10、0.15和0.20mg的溶液。精密量取各20l，注入液相色谱仪，记录色谱图以对照品溶液浓度的对数值与相应的峰面积对数值计算回归方程，相关系数（r）应不小于0.99；,测定法,供试品溶液：另取本品适量，精密称定，用水溶解并定量稀释制成每1ml中约含卡那霉素0.15mg的溶液同法测定，用回归方程计算供试品中卡那霉素的含量,返 回,测定法,【拓展提高】抗生素微生物检查法,中国药典（2010年版）附录XI A 抗生素微生物检定法是以抗生素抑制细菌生长的能力或其杀菌力来衡量抗生素活性（效价）的方法 优缺点 方法,管碟法,浊度法,微生物检定法优缺点,优点：测定原理与临床应用的要求一致，可直接反映抗生素的医疗价值灵敏度较高，供试品量较小，对产品纯度限度较宽适用于已知或新发现的抗生素。,缺点：操作步骤多测定时间长误差较大逐渐为一些适用范围广、灵敏度高的理化方法所代替,管碟法,利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生的抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法 实验菌株 方法简介,实验菌株,枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、,大肠埃希菌（Escherichia coli）、啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、肺炎克雷伯菌（Klebosiella Pneumoniae）、支气管炎博德特菌（Bordetella Bronchiseptica）。,返 回,方法简介,在直径约90mm、高1617mm的平底双碟中注入培养基底层，然后加入试验菌层，冷却后，在双碟中等距离均匀安置不锈钢小管4个（二剂量法）、6个（三剂量法），分别依法加入高低浓度的标准品溶液及供试品溶液，在规定条件下培养后，测量抑菌圈的直径或面积，进行统计分析及效价计算,返 回,浊度法,利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价 实验菌株 方法简介,实验菌株,金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠埃希菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Ca