诊断学-第二章溶贫8版151010

第二节溶血性贫血的实验室检测P260,溶血性贫血（hemolytic anemia）,一、定义 各种原因导致红细胞生存时间缩短、破坏增多或加速，而骨髓造血功能不能相应代偿而发生的一类贫血。正常骨髓有6-8倍的代偿能力,溶血性疾病 溶血性贫血溶血性黄疸,红细胞的可塑变形性(plastic deformation）,正常红细胞在外力作用下具有变形的能力， 称为 可塑变形性。 变形能力的大小与红细胞的形态、膜特性及内容物的性质和量有关。 例如：球形红细胞；膜弹性降低；Hb变性或浓度过高，粘度增高都可使红细胞变形性下降。,渗透脆性(osmotic fragility),概念：红细胞在低渗盐溶液中发生膨胀破裂的特性 渗透脆性反映红细胞抵抗低渗溶液的能力。 脆性大=抗低渗液的能力小=容易破 脆性小=抗低渗液的能力大=不易破,临床意义:衰老的红细胞，遗传性球形红细胞增多症其脆性特别大。,体内过程：成人每天需2030mg合成Hb，其中5%由食物补充，95%来自体内铁（衰老红细胞被巨噬细胞吞噬破坏，Hb分解释放的铁）的再利用。Fe3+需还原成Fe2+才能被利用。 进入血液的铁与转铁蛋白结合被运送到幼红细胞，来合成血红蛋白。 临床：造血功能增强而供铁不足（婴幼儿、孕妇、乳母），铁吸收利用障碍（胃酸、VitC缺乏)或铁丢失过多（慢性失血）缺铁性贫血（小细胞低色素性贫血）。可口服硫酸亚铁补充铁盐。,铁：Hb合成必需原料,平均寿命约为120天。90%的衰老红细胞在脾和骨髓等处被巨噬细胞吞噬（血管外破坏） ，吞噬后释放出的铁、氨基酸被重新利用，而脱铁血红素转变为胆色素随粪或尿排出体外。此外，10的衰老红细胞在血管内破坏，游离血红蛋白与结合珠蛋白结合被肝摄取。,红细胞的破坏,分类,（一）按病因和发病机制分类红细胞内在缺陷：多为遗传疾病红细胞外在因素损伤：均为后天获得性疾病,分类(二)按溶血发生部位分类（RBC破坏场所）血管内溶血血管外溶血,血管内溶血：急性溶血,红细胞,破坏（血循环中）,游 离 血 红 蛋 白,结合珠蛋白,血红蛋白尿,含铁血黄素尿,高铁血红蛋白白蛋白,血红蛋白尿,含铁血黄素尿,返回,Hb尿,含铁血黄素尿,血管外溶血：慢性溶血,红细胞,破坏（脾脏）,血红素,珠蛋白,循环血液红细胞,正常红细胞代谢,溶血性黄疸发生机理示意图,循环血液红细胞,血红蛋白非结合胆红素,与葡萄糖醛酸结合,结合胆红素,单核巨噬细胞系统,尿胆原,粪胆原,尿胆原,尿胆素,门静脉,三 、实验室检查,一 溶血性贫血的筛查检测,（一） 血浆游离Hb测定（敏感）正常值：50mg/L意义:血管内溶血时明显增加（60650mg/L） 血管外溶血时正常,（二） 血清结合珠蛋白测定（Hp）,正常值：0.71.5g/L溶血存在时，Hp减少。以血管内溶血时减低为显著。,（三）血浆高铁血红素清蛋白检测： 正常人： 阴性 阳性：严重血管内溶血。生化法高血红素清蛋白与硫化氨形成铵血色原，光谱仪观测在558nm处有一吸收光带电泳法醋酸纤维膜电泳，出现一条高铁血红素清蛋白带,（四）尿含铁血黄素试验（Rous test),铁离子在酸化的低铁氰化钾溶液中生成蓝色的铁氰化铁，即普鲁士蓝反应。,（五） RBC寿命测定,正常值：2532天51Cr同位素标记。溶血性贫血时半衰期15天，说明有溶血存在。,（六）Hb尿测定,红细胞代偿性增生的检查,网织红细胞计数（无特异性）正常：百分数0.51.5%绝对值（2484）109/L溶贫时达525%，甚至75%以上。,血象 见图骨髓象 见图,Cabots ring,嗜多色性红细胞,Howell-Jolly body,嗜碱点彩红细胞,骨髓象,幼红细胞显著增生，以中幼和晚幼红细胞最多，核分裂象多见。,二 红细胞膜缺陷的检测,红细胞膜上的蛋白（膜蛋白带、1、 2、收缩蛋白、骨架蛋白、功能蛋白 ）的数量或结构发生变化，出现形态和功能异常，发生溶血性贫血。遗传缺陷遗传性球形、椭圆形、口形红细胞增多症。细胞在脾脏清除，属于血管外溶血。后天获得性红细胞膜缺陷阵发性睡眠性血红蛋白尿, 膜上糖化肌醇磷脂（ GPI ）锚连蛋白异常。为慢性血管内溶血。,膜脂质丢失 = 变形能力下降 = 脾清除率增加,Normal,Hereditary spherocytosis,细胞膜,细胞骨架,红细胞膜缺陷的检验,红细胞渗透脆性试验,红细胞孵育渗透脆性试验,自身溶血试验及纠正试验,（一）红细胞渗透脆性试验 检测红细胞对不同浓度低渗盐溶液的抵抗力主要取决于红细胞表面积与其体积之比。表面积大而体积小对低渗盐水抵抗力较大（脆性较小），反之抵抗力较小（脆性增加）。,等体积的血液加入一系列的低渗NaCl溶液中; 达到平衡; 高速离心并测定光密度. 大多数正常RBC在NaCl浓度约 0.50%时开始结构破坏.当盐浓度进一步降低 渗漏和溶血增加.,正常渗透脆性,HS时低渗溶液中的异常溶血,参考值 开始溶血：0.42%0.46%（4.24.6g/L）NaCI 完全溶血：0.28%0.34%（2.83.4g/L）NaCI,临床意义 开始溶血0.50、完全溶血0.38 为脆性增高 （1）脆性增高 遗传性球形红细胞增多症 （2）脆性减低 小细胞低色素性贫血：海洋性贫 血、缺铁性贫血,（二）红细胞孵育渗透脆性试验原理：37孵育24小时，细胞内葡萄糖消耗增加，ATP减少，钠离子泵出减少，细胞膨胀脆性增高 。参考值 未孵育 50%溶血44.45g/L 孵育 50%溶血4.655.9g/L意义 ： 1、脆性增高：遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形细胞增多症、遗传性非球形细胞溶血性贫血。2、脆性减低：缺铁性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血。,（三）自身溶血试验及其纠正试验,红细胞在37孵育48小时，其间由于膜异常引起钠内流倾向明显增加，ATP消耗过多；或糖酵解途径酶缺乏所引起ATP生成不足等原因可导致溶血，称为自身溶血试验。在孵育时，加入葡萄糖或ATP作为纠正物，观察溶血可否有一定的纠正，称为纠正试验。参考值：正常人轻微溶血，溶血度3.5%； 加葡萄糖、ATP溶血明显纠正， 溶血度5% ，多者可50% G6PD缺陷 ： ATP：可纠正 但不能纠至正常 G： 同上 PK缺陷 ： ATP：可纠正 G： 不纠正,（一） 高铁血红蛋白还原试验,G6P 6-PGA 核酸-5-磷酸,NADPH是高铁血红蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶的辅酶。 G6PD缺陷NADPH减少时，高铁血红蛋白和谷胱甘肽还原下降。,参考值：高铁血红蛋白还原率75% 高铁血红蛋白0.3-1.3g/LG6PD缺陷高铁血红蛋白还原率明显下降,（三）变性珠蛋白小体生成试验,受检RBC乙酰苯肼 作活体染色（甲基紫） 有变性珠蛋白小体，则膜上形成紫黑色颗粒计算含5个及以上珠蛋白小体的红细胞的百分率 正常人含5个及以上珠蛋白小体的红细胞一般小于30% 见图,3712h,G6PD缺乏症常高于45%，故可作为G6PD缺乏的筛检试验。还原型谷胱甘肽缺乏症也增高。不稳定血红蛋白病含小体的细胞百分率为75%84%。HbH病和化学物质中毒时也增高。（ G6PD缺乏症，NADPH减少时，红细胞内还原型谷胱甘肽减少，高铁血红蛋白增高，形成变性珠蛋白小体）,Heinz Body Haemolytic Anaemia,G6PD deficiency is the most common enzymopathy causing hereditary haemolytic anaemia.,咬合形细胞 、 盔形红细胞,水泡细胞Blister cell,Heinz bodies,G6P 6-PGA 核酸-5-磷酸,NADPH在紫外线照射下会发出荧光NADPH的吸收峰在波长340nm处，可通过单位时间 生成的NADPH的量来测定G-6-PD活性。 正常人有很强荧光,酶活性为（4.971.43）U/gHbG-6-PD缺陷者荧光很弱或无荧光杂合子或某些G-6-PD变异者则可能有轻到中度荧光,(4)G6PD荧光斑点试验和活性测定,(5) PK荧光斑点试验和活性测定,标记荧光于NADH上，此时有荧光的NADH变为无荧光的NAD 正常人PK活性斑点在20钟内消失,酶活性15.11.99 U/gHb 荧光斑点不消失或时间延长说明PK活性缺乏中间缺乏（杂合子）时，荧光25min60min消失严重缺乏（纯合子）时，荧光60min不消失。,PEP,PK,ADP,ATP,丙酮酸,LD,NADH,NAD,乳酸,四 珠蛋白生成异常的检测,血红蛋白由珠蛋白和血红素构成，珠蛋白分子由两对肽链组成，一对是链，另一对是非链（、），正常成人血红蛋白有3种：HbA(22)、HbA2 (2 2)、HbF(2 2)。 珠蛋白异常分为两大类，一类是某个肽链合成量减少，即地中海贫血（ 、 ），另一类是多肽链的结构发生质的改变，即异常血红蛋白病。,（一）血红蛋白电泳检测： 醋酸纤维膜电泳法，检查有无异常血红蛋白区带。 诊断地中海贫血,异常HB带,+,醋酸纤维蛋白膜电泳,临床意义：HbA2：-地中海贫血。恶贫、巨贫轻度。HbA2：缺铁、铁粒幼红细胞贫血。（二）胎儿Hb酸洗脱试验HbF抗酸能力较强，不易被酸洗脱。血片置酸性缓冲液保湿一定时间。含HbF的红细胞不被洗脱，再用伊红染色呈鲜红色成人1%，地中海贫血轻型少数RBC呈阳性，重型阳性RBC明显增多。,（三）胎儿血红蛋白测定或HbF碱变性试验在碱性溶液中， HbF不易变性沉淀，其他Hb在碱性溶液中易变性沉淀，测定滤液中Hb含量，即HbF含量。成人2%，新生儿5585%, 1岁左右同成人增高：地中海贫血明显（8090%）。急性白血病、再障、红白血病、淋巴瘤轻度。（四）HbA2定量测定：1.13.2%临床意义同Hb电泳,（五）限制性内切酶谱分析：意义：Hb病的基因诊断。,五 自身免疫性 溶血性贫血检测,自身免疫性溶血性贫血（autoimmune hemolytic anemia AIHA） 是体内免疫发生异常，产生自身抗体或（和）补体。结合在RBC膜上， RBC 易被单核巨噬细胞系统所吞噬，RBC破坏加速而引起一组溶血性贫血。,（一）抗人球蛋白试验 （ Coombs） 原理 ： 直接抗人球蛋白试验： 自身免疫性溶血性贫血（AIHA）血清中有抗自身红细胞的不完全抗体，他与表面附有相应抗原的红细胞结合，成为致敏红细胞，加入抗人球蛋白与红细胞表面不完全抗体结合，使红细胞相互连接起来出现凝集现象。来证实红细胞表面有不完全抗体。抗人球蛋白直接试验阳性间接抗人球蛋白试验 ：检查血清中有无游离的不完全抗体，敏感性差。,抗人球蛋白,IgG不完全抗体,RBC,直接抗球蛋白试验（DAT） 阳性（右）,参考值：正常人抗人球蛋白试验直接、间接均阴性。临床意义： 新生儿溶血病、AIHA等。自身免疫性溶血性贫血阳性（主要见于温抗体型 ，在37条件下作用最强 IgG）,(冷抗体型 4条件下进行试验 IgM) 间接抗人球蛋白试验：新生儿同种免疫溶血病母体血清中不完全抗体的检测。,（二）冷凝集素试验原理：冷凝集素是一种可逆性抗体，在低温时可与自身RBC、“O”型RBC或与患者同型RBC发生凝集，当温度升高时，凝集块又复消失。参考值：效价1：40，适合温度4。临床意义：冷抗体型（ IgM ）AIHA病人效价很高。,（三）冷热双相溶血试验（Donath-Landsteiners test ,D-L test） 原理：阵发性寒冷性血红蛋白尿症（PCH）病人血清中有双相溶血素，在04 时，溶血素与RBC结合，并吸附补体，但不溶血；当升高至3037则发生溶血。临床意义：阳性：见于PCH；麻疹、水痘、流行性腮腺炎，传染性单核细胞增多症。,（六）阵发性睡眠性血红蛋白尿症有关检测,阵发性睡眠性血红蛋白尿,Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria（PNH）是一种获得性造血干细胞基因突变引起的慢性血管内溶血，异常PNH细胞缺乏一种通过糖肌醇磷脂连接在细胞表面膜蛋白，导致细胞对激活补体异常敏感，临床表现以与睡眠有关的、间歇发作的血红蛋白尿为特征。,病因发病机制 造血干细胞发生基因突变，导致糖化磷脂酰肌醇（GPI）合成障碍,使异常造血干细胞分化而来的血细胞膜出现GPI连接蛋白缺陷,异常血细胞对补体敏感而破坏,导致溶血. PNH细胞可以是白细胞或红细胞。,20-40岁多发，男性女性 1、血红蛋白尿 以此首发者占1/4，酱油、葡萄酒样，乏力、胸骨后及腰腹部疼痛、发热，晨间重、下午轻，睡眠有关。 睡眠呼吸中枢敏感性酸性物细胞溶血. 2、贫血、感染、出血 3、血栓形成：肝、肠系膜、肢体末梢血管 RBC破坏促凝物Plt膜聚集 补体Plt膜聚集,临床表现：,PNH是红细胞膜的获得性缺陷引起的对激活补体异常敏感的一种慢性血管内溶血，临床表现以与睡眠有关的、间歇发作的血红蛋白尿为特征，可伴有全血细胞减少或反复血栓形成。,PNH不同时间尿样,含铁血黄素,（ 1）酸溶血试验 (Ham) 原理：红细胞+弱酸血清（pH6.66.8） 37 1小时 红细胞膜对补体敏感， 备解素作用下溶血。,临床意义：正常人阴性， 阵发性睡眠性 血红蛋白尿阳 性（PNH）,Ham试验,（2）蔗糖水溶血试验 离子浓度低，增强补体与红细胞结合，膜 孔，蔗糖进入-细胞破坏,原理：蔗糖溶液离子浓度低，经孵育可加强补体与RBC膜的结合，使PNH病人的RBC膜上形成小孔，随之蔗糖进入RBC而导致溶血。PNH阳性，巨贫、再障、AIHA、先天性球形红细胞增多症轻度溶血。筛选试验。,（3）蛇毒因子溶血试验 眼镜蛇毒中提取的一种蛋白质，它能直接激活血清中的补体C3，通过旁路激活补体系统，PNH红细胞破碎而引起溶血。特异性PNH试验。,流式细胞仪检测CD55和CD59 PNH时，红细胞、淋巴细胞、粒细胞和单核细胞的细胞膜上CD55和CD59表达下降。分子生物学方法检测GPI锚连蛋白 PNH 时， GPI （糖化肌醇磷脂）锚连蛋白缺乏。,血管内溶血血浆游离HB检测 血红蛋白尿血浆高铁血红素清蛋白检测：含铁血黄素尿试验（Rous试验）：血管外溶血 血清间接胆红素 增高尿胆原增高血管内外溶血 RBC寿命测定血清结合珠蛋白检测：,红细胞膜缺陷的检验,红细胞渗透脆性试验,RBC孵育渗透性试验 脆性增高 遗传性球形红细胞增多症 脆性减低 海洋性贫血、缺铁性贫血自身溶血试验及纠正试验 1、球形RBC增多症时，溶血明显增加，加葡萄糖、ATP溶血明显纠正。 2、G-6-PD缺乏症溶血增加，加葡萄糖、ATP溶血部分纠正。 3、PK缺乏症加葡萄糖不能纠正。加入ATP能纠正。,血管内溶血1、疑PNHHam试验、蔗糖溶血试验、Rous试验、蛇毒溶血试验2、疑AIHACoombs（直接、间接）、冷凝集试验（冷凝集综合症阳性）、冷热双相溶血试验（PCH）,溶血性贫血思考题溶贫（血管内或血管外）为什么引起高胆红素血症？红细胞酶缺陷常用哪些实验？常见哪些疾病？红细胞膜缺陷常用哪些实验？常见哪些疾病？海因小体是如何形成的？PNH的实验室检查有哪些？最常用的试验？AIHA的实验室检查有哪些？最常用的试验？检查红细胞表面不完全抗体首选哪种试验？血管内、外溶血的化验结果有何不同？,概念：溶血性贫血 海因小体 血管内溶血 血管外溶血 PNH AIHA,1、男12岁，自幼贫血，脾肋下2cm， Hb80g/L, RBC脆性试验增加，球形红细胞25%。 考虑为何种疾病？ 此病人为何种溶血？（血管内或血管外）， 需要进一步做何种检查？,2、患者，女，30岁，头昏乏力，贫血貌，脾大