生物化学-第二章蛋白质

第二章蛋白质 Protein 化学 蛋白质存在于所有的生物细胞中 是构成生物体最基本的结构物质和功能物质 蛋白质是生命活动的物质基础 它参与了几乎所有的生命活动过程 学习目的与要求 1 蛋白质化学的基本组成单位 2 氨基酸的结构 性质及分离测定方法 3 肽及其结构 4 蛋白质的结构 性质 功能及分离纯化与测定原理方法 重点1 氨基酸的结构及性质 2 蛋白质的结构 性质 功能 3 氨基酸及蛋白质的分离测定方法 难点1 氨基酸的两性性质 2 蛋白质一级结构的测定3 蛋白质的二级结构的要点4 蛋白质结构与功能的关系 1 蛋白质是生物体内的结构高分子 第一节蛋白质导言 一 蛋白质是生命的物质基础 2 蛋白质是一种生物体内的功能高分子 1 酶的催化作用 2 调节作用 多肽类激素 3 运输功能 4 运动功能 5 免疫保护作用 干扰素 6 接受 传递信息的受体 7 毒蛋白 二 蛋白质的元素组成 这些元素在蛋白质中的组成百分比约为 碳50 55 氮15 17 铁 锌 锰 钼 碘 铜等氢6 8 硫0 4 氧20 23 磷0 1 蛋白质是一类含氮有机化合物 除含有碳 氢 氧外 还有氮和少量的硫 某些蛋白质还含有其他一些元素 主要是磷 铁 碘 碘 锌和铜等 其中氮含量较恒定 平均16 一克氮 6 25克蛋白质 这是凯氏定氮法的依据 三 蛋白质的水解 基本单位氨基酸 证明 氨基酸是蛋白质的基本组成单位 一 氨基酸的结构通式 1 特点 氨基酸的结构决定了有如下特点 具有酸性的羧基和碱性的氨基 碳为手性碳原子 由于R侧链不同 或 分子型 离子型 2 非蛋白氨基酸 二 氨基酸的分类 第二节氨基酸的性质 一 氨基酸的光学活性和光吸收性质 1 氨基酸的光学活性 酪氨酸的 max 278nm 278 1 4x103 苯丙氨酸的 max 259nm 259 2 0 x102 色氨酸的 max 279nm 279 5 6x103 2 氨基酸的光吸收 二 氨基酸的解离和两性性质 氨基酸在结晶形态或在水溶液中 并不是以游离的羧基或氨基形式存在 而是离解成两性离子 在两性离子中 氨基是以质子化 NH3 形式存在 羧基是以离解状态 COO 存在 1 两性离子 同一分子中既有带正电荷的离子又有带负电荷的离子 这种离子称为两性离子 2 氨基酸的等电点 在一定的pH值时 氨基酸分子中氨基的离解度等于羧基的离解度时 所含的 NH3 和 COO 数目正好相等 净电荷为0 在电场中既不向正极移动 也不向负极移动 这一pH值即为氨基酸的等电点 简称pI 在等电点时 氨基酸既不向正极也不向负极移动 即氨基酸处于两性离子状态 3 氨基酸的等电点的计算 等电点时 等式两边取负对数 logK1 logK2 2 log H pK1 pK2 2pH 侧链不含离解基团的中性氨基酸 其等电点是它的pK 1和pK 2的算术平均值 pI pK1 pK2 2 等电点等于酸性基团离解常数与碱性基团离解常数之和的一半 或等电点等于两性离子两侧离解基团离解常数之和的一半 Lys的解离如下 Asp解离如下 4 根据滴定曲线求pK 三 氨基酸的化学反应 1 与甲醛反应 一 氨基参与的反应 2 与亚硝酸反应 此反应是Vanslyke定氮的原理 3 与2 4 二硝基氟苯 DNFB 反应 4 与异硫氰酸苯酯 PITC 的反应 5 与丹磺酰氯反应 在碱性条件下 丹磺酰氯 二甲氨基萘磺酰氯 可以与N 端氨基酸的游离氨基作用 得到丹磺酰 氨基酸 此法的优点是丹磺酰 氨基酸有很强的荧光性质 检测灵敏度可以达到1 10 9mol 二 羧基参与的反应 肼解反应 此法是多肽链C 端氨基酸分析法 多肽与肼在无水条件下加热 C 端氨基酸即从肽链上解离出来 其余的氨基酸则变成肼化物 肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C 端氨基酸分离 三 氨基和羧基共同参与的反应 茚三酮反应 脯氨酸 羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色物质 入max 440nm 四 R 侧链反应 呈色反应 第三节 氨基酸的分离与测定 一 层析法 1 层析法原理 层析法是利用被分离样品混合物中各组分的化学性质的差异 如溶解度 吸附力 电荷性质等 使各组分以不同程度分布在两个 相 中 固定相 被固定在一定的支持介质上的那一相 流动相 在支持介质上移动的那一相 当移动相流过固定相时 在流动过程中 由于各组分在两相中的分配情况不同 电荷或亲和力不同等 以不同的速度移动 从而达到分离 2 层析方法 根据层析法的原理 根据层析法的支持介质不同 滤纸层析薄层层析薄膜层析等离子交换层析法凝胶过滤层析法 1 滤纸层析 滤纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法 分配定律 当一种溶质在两种一定的互不相溶或几乎互不相溶的溶剂中分配时 在一定的温度下达到平衡后 溶质在两相中的浓度比与在这两种溶剂中的溶解度比值相等 这个比值是一个常数 称为分配系数 以K表示 固定相 水 流动相 水饱和的有机溶剂 X Y 影响迁移率的因素 内因 氨基酸的性质 外因 溶剂 滤纸 温度 层析方式等 2 离子交换层析 离子交换树脂是一种具有酸性或碱性基团的人工合成的高分子化合物 酸性基团 交换阳离子 碱性基团 交换阴离子 由于不同的氨基酸PI不同 在一定的PH溶液中带电荷的性质不同 带电荷的多少不同 与不同的离子交换树脂的结合能力不同 洗脱时不能结合的最先被洗脱出来 结合能力小的其次 结合能力大的最后被洗脱出来 二 电泳法 1 原理 电泳 是指带电的质点在电场中向本身电荷相反的电极移动的现象 带电质点移动的速度与外加电场强度 质点本身所带电荷成正比 而与介质的黏度 质点大小成反比 2 方法 根据支持物不同可分为 三 氨基酸含量的测定 主要根据氨基酸的化学性质及其特定的化学呈色反应来测定 第四节肽 一 肽的结构 二 生物活性肽 H3N Tyr Gly Gly Phe Met COO Met 脑啡肽 H3N Tyr Gly Gly Phe Leu COO Leu 脑啡肽 1 谷胱甘肽 2 脑啡肽 4 短杆菌肽S Orn鸟氨酸 3 催产素与加压素 第五节蛋白质分类 一 根据蛋白质分子形状分类 1 球状蛋白2 纤维状蛋白 二 根据蛋白质的组成成份分类 1 单纯蛋白2 结合蛋白清蛋白核蛋白谷蛋白和醇溶谷蛋白色蛋白精蛋白和组蛋白糖蛋白硬蛋白脂蛋白磷蛋白 第六节蛋白质的一级结构 一 蛋白质的氨基酸组成 1 蛋白质的氨基酸组成可用残基重量百分数表示 147165 如 100克胰岛素分析得到phe8 6克 其重量百分数为 残基分子量 2 根据百分组成计算氨基酸的分子个数 如 胰岛素分子量为6000 丙氨酸占4 6 氨基酸个数为 a盐键 离子键 b氢键c疏水相互作用力d范德华力e二硫键f酯键 二 蛋白质分子结构中的化学键 维系蛋白质分子的一级结构 肽键维系蛋白质分子的二级结构 氢键维系蛋白质分子的三级结构 疏水相互作用力维系蛋白质分子的四级结构 范德华力 盐键 氢键 疏水相互作用力 氢键 范德华力 疏水相互作用力 盐键 均为次级键氢键 范德华力虽然键能小 但数量大疏水相互作用力对维持三级结构特别重要盐键数量小二硫键对稳定蛋白质构象很重要 二硫键越多 蛋白质分子构象越稳定 三 蛋白质一级结构的测定 一 氨基酸组成成分分析 二 末端分析1 N 末端2 C 末端 三 肽链伸展与分离 四 肽链部分水解与肽段分离 五 肽段的氨基酸顺序测定 六 由各段顺序推断的氨基酸顺序 化学法 溴化氰水解法 它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键 酶法 第七节蛋白质的高级结构 一 高级结构的概念 1 螺旋 二 二级结构 要点 螺旋的角度与高度维持螺旋的作用力影响螺旋稳定的因素螺旋的种类 2 折叠 要点 肽链的走向 种类 残基轴心距离维持的作用力影响 折叠稳定的因素 3 转角 4 自由回折 氢键 1800的回转 自由回折 三 超二级结构 四 三级结构 要点 形状折叠作用力 蛋白质多肽链在二级或超二级结构的基础上进一步纽曲折叠形成很不规则但具有特定构象的蛋白质分子 1 外圆中空 极性基团分布分子的外侧 非极性基团在分子内形成孔穴 2 片段折叠 片段折叠成7 8段 每段为螺旋结构 75 3 作用力 疏水力 五 四级结构 两条或两条以上具有三级结构的多肽链组合在一起形成特定构象的蛋白质分子 四级结构中具有三级结构的多肽链称为亚基 亚基单独存在没有活性 作用力 次级键 一级结构 二级结构 超二级结构 结构域 三级结构 亚基 四级结构 第八节 个别蛋白质结构与功能 一 纤维状蛋白 不溶于水可伸缩不被酶水解氨基酸与球蛋白不同 胱氨酸含量22 主要氨基酸为甘 丙 丝3条右向左缠绕 直径2nm二硫键维持 1 角蛋白 2 丝心蛋白 甘 丙 丝为87 不含CysGly Ser Gly Ala Gly Ala六肽重复 3 胶原蛋白 氨基酸组成 甘氨酸35 丙氨酸11 脯氨酸12 羟脯氨酸9 少量羟赖氨酸氨基酸排列 每间隔两个氨基酸就有一个甘氨酸 每两个甘氨基酸间的两个氨基酸之一为脯氨酸或羟脯氨酸胶原蛋白的分子结构单位 原胶原 原胶原分子定向排列整齐原胶原分子大小 直径14 长300 相对分子量36000原胶原分子肽链组成 3条 每条1000氨基酸 每条肽链为左手螺旋 3条肽链相互缠绕成为右手螺旋 肽链间氢键联系 二 球状蛋白 1 球状 圆形 2 亲水3 极性基团分布于分子外侧非极性基团分布于分子内侧 三 糖蛋白 1 糖蛋白的概念 是一类糖与蛋白质的共价键连接而成的结合物 2 糖蛋白的分布 动物 植物 微生物 胞内 胞外 组织 体液如 神经组织 眼球水晶体液 眼角膜 视网膜等 3 糖蛋白的存在形式 结合 可溶如 细菌细胞壁的肽聚糖 植物的凝集素 酶等 4 糖链 直链 支链 1个糖基 数百个糖基 同多糖 杂多糖 5 单糖种类 单糖及其衍生物10种 木糖 阿拉伯糖 五碳糖 葡萄糖 半乳糖 甘露糖 岩藻糖 六碳糖 N 乙酰葡萄糖胺 N 乙酰半乳糖胺 氨基糖 神经氨酸 羟乙酰神经氨酸 唾液酸 7 糖蛋白的功能 催化功能 调节功能 运输功能 载体 信息传递功能 受体 免疫保护功能 细胞识别 其它 四 脂蛋白 1 脂蛋白的概念 是指脂质同蛋白质以次级键结合而成的结合物 2 脂蛋白的分布 细胞和血液 细胞脂蛋白 主要存在于生物膜 脂质主要是磷脂 其次是糖脂 不同种属细胞脂蛋白的蛋白质和脂质在质与量上有较大差异 血浆脂蛋白 血浆脂蛋白又称可溶性脂蛋白 在水中部分溶解 3 脂蛋白的种类 型 密度较大 1 063 1 21g mL 电泳时同 球蛋白一起移动 型 密度较小 1 063g mL 电泳时同 球蛋白一起移动 4 载脂蛋白 脂蛋白中的蛋白质部分 分为 apoA AI A A apoB B48 B100apoC CIC C apoDapoE 5 脂蛋白的功能 转运脂质及固醇类物质 CM 转运外源性脂肪VLDL 转运内源性脂肪LDL 肝胆固醇转运到肝外HDL 肝外胆固醇转运到肝内VHDL 转运脂肪酸 第九节蛋白质分子结构与功能 一 一级结构与功能的关系 例如 胰岛素的结构与功能 胰岛素为A B两链由51个氨基酸组成 A链21个氨基酸 B链30个氨基酸 不变 与活性有关6个Cys的位置不变可变 与免疫有关常变的有B30 A8 9 10 一 同功能蛋白中氨基酸顺序的种属差异 例如 细胞色素C与生物进化 二 生物进化中同功能蛋白质在结构上的变化 例如 血红蛋白结构与功能 三 蛋白质结构上的变化与功能的改变 二 蛋白质的构象与功能的关系 一 月元病毒构象与功能的关系 二 血红蛋白构象与功能的关系 第十节蛋白质的性质 一 蛋白质的两性解离和等电点 蛋白质与多肽一样 能够发生两性离解 也有等电点 在等电点时 IsoelectricpointpI 蛋白质的溶解度最小 在电场中不移动 在不同的pH环境下 蛋白质的电学性质不同 在等电点偏酸性溶液中 蛋白质粒子带负电荷 在电场中向正极移动 在等电点偏碱性溶液中 蛋白质粒子带正电荷 在电场中向负极移动 这种现象称为蛋白质电泳 Electrophoresis 二 蛋白质的分子大小 1 根据化学成分测定最小相对分子质量 据其百分含量可计算出最低相对分子质量 2 沉降系数 一个S单位 为1 10 13秒蛋白质的沉降系数 1 200S 相对分子质量越大 S值越大由沉降系数S可根据斯维得贝格 Svedberg 方程计算蛋白质分子的相对分子质量 M RST D 1 i R 气体常数T 绝对温度D 扩散系数 溶剂的密度 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸 酪氨酸和色氨酸 这三种氨基酸的在280nm附近有最大吸收 因此 大多数蛋白质在280nm附近显示强的吸收 利用这个性质 可以对蛋白质进行定性鉴定 三 蛋白质的紫外吸收性质 由于蛋白质的分子量很大 它在水中能够形成胶体溶液 蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质 如丁达尔现象 布郎运动等 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜 因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去 稳定因素 电荷作用 水化作用 四 蛋白质的胶体性质 五 蛋白质的沉淀作用 蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小 所带的电荷和水化作用有关改变溶液的条件 将影响蛋白质的溶解性质在适当的条件下 蛋白质能够从溶液中沉淀出来 沉淀原因 破坏胶体稳定因素 变性 沉淀的方法有