HPLC培训(峰与色谱条件)

HPLC 高效液相色谱 基本原理加样流动相流动相ACBBCA固定相 柱内填料 流动相 洗脱剂 HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同 进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程 基本操作 1 打开泵电源 待自检完成后打开 Purge 阀进行排液以除去泵头之前的气泡 排气完成后关闭 Purge 阀 按 Pump 键开启泵 然后按 func 及数字键以0 2ml min的速度慢慢将流速调1 0ml min 其中测甘油果糖氯化钠注射液时应以0 1ml min的速度慢慢将流速调0 5ml min 2 一般柱平衡时间为30min左右 测甘油果糖氯化钠注射液时平衡时间会更长些 此时依次打开检测器 工作站电源 打开计算机中工作站 待仪器自检连接完成后查看基线 如基线平稳即可进样采集数据 3 检测完成后 关闭计算机中工作站 检测器 工作站电源 将泵的流速慢慢降至0 2ml min 按 Pump 键关闭泵 将流动相换至10 甲醇水或乙腈水 再以1 0ml min流速冲洗色谱柱30 60min 4 最后将色谱柱充满纯甲醇保存 5 手动进样器使用后 用适当溶剂冲洗进样阀 除去残留的样品 溶剂 缓冲盐等 盖好封盖防止灰尘颗粒 流动相的配制 配制用水最好用蒸馏水 注射水 称量 量取 调pH时尽可能精确 流动相必须用0 45um滤膜过滤 注意区分有机膜 无机膜 加入甲醇或乙腈后要混合充分 流动相必须经过脱气 常用方法是超声脱气 配制所用的试剂尽可能用色谱纯 如没有色谱纯可用分析纯代替 流动相应现用现配制 染菌的流动相禁止使用 配制过程中应注意自我保护 流动相使用前为什么要脱气 流动相使用前必须进行脱气处理 以除去其中溶解的气体 如O2 以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时 因压力降低而产生气泡 气泡会增加基线的噪音 造成灵敏度下降 甚至无法分析 溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化 柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能 常用的脱气方法比较 氦气脱气法加热回流法 效果较好 但操作复杂 且有毒性挥发污染 抽真空脱气法 易抽走有机相 超声脱气法 流动相放在超声波容器中用超声波振荡 超声过程中观察无气泡生成即可 在线真空脱气法 真空脱机利用膜渗透技术在线脱气 无需额外操作 成本低 脱气效果明显优于以上几种方法 并适用于多元溶剂体系 色谱柱的良好使用规范 溶剂使用前必须过滤运输中变干了的色谱柱要完全浸湿 预处理 如果样品中含有无需考虑而保留强的组分时 必须进行前处理清楚了解色谱柱填料适用的pH范围 3 7 温度 60 化学适应性使用新鲜的水溶液 流动相现用现配制定期用强极性溶剂冲洗色谱柱储存色谱柱时 要将缓冲液冲洗干净 并保存在适合的溶剂中 如甲醇 乙腈避免操作不当损坏色谱柱 如 猛敲 跌落或过紧拧接头 最常用的 万能柱 填料为 C18 简称 ODS 柱 即十八烷基硅烷键合硅胶填料 Octadecylsilyl 简称ODS 这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用 它可完成高效液相色谱70 80 的分析任务 由于C18 ODS 是长链烷基键合相 有较高的碳含量和更好的疏水性 对各种类型的生物大分子有更强的适应能力 因此在生物化学分析工作中应用的最为广泛 按键合到基质上的官能团可分为 反相柱 填料为非极性 官能团为烷烃 例如 C18 ODS C8 C4等 正相柱 填料为极性 官能团为 CN氰基 NH2氨基等 离子交换键合相 阳离子官能团 SO3H磺酸基 COOH羧基等 阴离子官能团 R4N 季铵基 氨基等 由于硅胶基质的键合相只能在pH 2 7 5的范围内使用 而离子交换色谱要求有更宽的pH范围 因此其基质现在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯 色谱柱的故障诊断 基线噪音 可能的原因 1 流动相脱气不彻底2 检测器流通池污染或有气泡3 检测器光源能量不稳4 周期性噪音可能由泵的脉动引起5 电子放大电路不稳定 色谱柱故障诊断 基线漂移 可能的原因梯度洗脱流动相不干净温度波动 对示差折光检测器影响更大 流动相与色谱柱未达到平衡系统中污染物流失电子线路不稳定检测器预热时间不够进样器中残留 硬件与流动相不相容 如Peek材料与不合适的有机溶剂合用 色谱柱故障诊断 鬼峰 鬼峰 是指在未进样时也能出现的色谱峰原因 1 流动相不干净 尤其是弱极性流动相 RPC中水的纯度比甲醇影响更大 2 样品的交叉污染 色谱柱故障诊断 峰形问题 可能的原因 1 色谱柱柱床塌陷 出现死体积2 过滤片部分堵塞3 两个组分共同流出 形成一个峰 DAD 4 样品溶剂不匹配 色谱柱故障诊断 峰形问题 所有的峰都变宽1 柱效降低 柱床塌陷2 进样体积 质量 过大3 流动相黏度太大4 样品溶剂与流动相不匹配有些峰变宽1 上一次进样时未洗脱出来的峰2 样品分子量太大 如蛋白质或聚合物反应峰 色谱柱故障诊断 峰形问题 可能的原因有些峰拖尾1 二次保留效应 残留的硅羟基影响2 在大峰的尾部有小峰流出 DAD 所有的峰都拖尾1 柱外效应2 金属离子影响 酸洗 3 样品过载或溶剂不合适4 柱头交叉污染或柱已损坏 拖尾峰 对称因子 1 2 色谱柱故障诊断 峰形问题 可能的原因1 小峰在大峰前流出2 柱床塌陷3 样品溶剂不合适4 柱过滤片部分堵塞5 柱过载 偶尔发生 手动进样器的使用 维护 样品溶液进样前必须用0 45um滤膜过滤 以减少微粒对进样阀的磨损转动切换时不能太慢 更不能停留在中间位置 否则流动相受阻 使泵内压力剧增 甚至超过泵的最大压力避免使用针头弯曲 毛刺 变钝的进样针使用后 用适当溶剂冲洗进样阀 除去残留的样品 溶剂 缓冲盐等 盖好封盖防止灰尘颗粒必要时更换转子密封垫 系统适应性试验 1 色谱柱的理论板数 2 分离度 3 重复性4 拖尾因子 色谱柱的理论塔板数 n 用于评价色谱柱的分离效能 n 16 tR w 2或n 5 54 tR wh 2 2计算色谱柱的理论板数 保留时间tR峰宽w半高峰宽wh 2 分离度 R 用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程序 是衡量色谱系统效能的关键指标 除另有规定外 待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1 5 计算公式或 重复性 用于评价连续进样中 色谱系统响应值的重复性能 采用外标法时 通常取各品种项下的对照品溶液 连续进样5次 除另有规定外 其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2 0 相对标准偏差RSD采用内标法时 其相对标准偏差应不大于2 0 拖尾因子 T 用于评价色谱柱的对称性 为保证分离效果和测量精度 应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定 拖尾因子计算公式为 除另有规定外 峰高法定量时T应在0 95 1 05之间 峰面积法测定时 若拖尾严重 将影响峰面积的准确测量 系统适应性试验1 理论塔板数n2 分离度 R 1 5 3 重复性RSD 0 1 4 拖尾因子T 1 04 替硝唑含量 理论塔板数 15487对称因子 1 05 含量测定 内标法 按各品种项下的规定 精密称 量 取对照品和内标物质 分别配成溶液 精密量取各适量 混合配成规定用的对照溶液 取一定量注入仪器 记录色谱图 测量对照品和内标物质的峰面积或峰高 按下式计算校正因子 校正因子 f AS CS AR CR式中 AS为内标物质的峰面积或峰高 AR为对照品的峰面积或峰高 CS为内标物质的浓度 CR为对照品的浓度 再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液 注入仪器 记录色谱图 测量供试品中待测成分 或其杂质 和内标物质的峰面积或峰高 按下式计算含量 含量 cX f Ax C S As式中 AX为供试品 或其杂质 峰面积或峰高 CX为供试品 或其杂质 的浓度 A S为内标物质的峰面积或峰高 C S为内标物质的浓度 f为校正因子 采用内标法 可避免因样品前处理及进样体积误差对测量结果的影响 含量测定 外标法 按各品种项下的规定 精密称 量 取对照品和供试品 配制成溶液 分别精密量取一定量 注入仪器 记录色谱图 测量对照品溶液和供试品溶液中待测组分的峰面积 或峰高 按下式计算含量 含量 CX cR Ax AR式中各符号意义同上 由于微量注射器不易精确控制进样量 当采用外标法测定供试品中成分或杂质含量时 以定量环或自动进样器进样为好 替硝唑有关物质 其中杂质与2 甲基 5硝基咪唑的分离度为1 69 有关物质 1 加校正因子的主成分自身对照法测定杂质含量时 可采用加校正因子的主成分自身对照法 在建立方法时 按各品种项下的规定 精密称 量 取杂质对照品和待测组分对照品各适量 配制测定杂质校正因子的溶液 进样 记录色谱图 按上述内标法计算杂质的校正因子 此校正因子可直接载入各品种项下 用于校正杂质的实测峰面积 这些需作校正计算的杂质 通常以主成分为参照 采用相对保留时间定位 其数值一并载入各品种项下 测定杂质含量时 按各品种项下规定的杂质限度 将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液 进样 调节检测灵敏度 以噪声水平可接受为限 或进样量 以柱子不过载为限 使对照溶液的主成分色谱峰的峰高约达满量程的10 25 或其峰面积能准确积分 通常含量低于0 5 的杂质 峰面积的相对标准偏差 RSD 应小于10 含量在0 5 2 的杂质 峰面积的RSD应小于5 含量大于2 的杂质 峰面积的RSD应小于2 0 然后 取供试品溶液和对照品溶液适量 分别进样 供试品溶液的记录时间 除另有规定外 应为主成分色谱峰保留时间的2倍 测量供试品溶液色谱峰上各杂质的峰面积 分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较 依法计算各杂质含量 2 不加校正因子的主成分自身对照法测定杂质含量时 若没有杂质对照品 也可采用不加校正因子的主成分自身对照法 同上述 3 法配制对照品溶液并调节检测灵敏度后 取供试品溶液和对照品溶液适量 分别进样 前者的记录时间 除另有规定外 应为主成分色谱峰保留时间的2倍 测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照品溶液主成分的峰面积比较 计算杂质含量 若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离 则按规定先记录供试品溶液