基因工程基本操作程序

1 1 2基因工程操作的基本步骤 课标要求1 基因工程的原理是什么 2 说出基因工程的基本操作步骤3 设计某一转基因生物研制过程 2 一 基因工程的原理是什么 基因工程是指按照人们的愿望 进行严格的设计 通过体外DNA重组和转基因等技术 赋予生物以新的遗传特性 创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品 3 二 基因工程操作的基本步骤 提取目的基因目的基因与运载体结合 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞目的基因的检测和表达 4 讨论分析基因工程操作每个步骤的必要性 提取目的基因目的基因与运载体结合 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞目的基因的检测和表达 5 基因工程操作程序中每一步的必要性 1 没有第一步 就谈不上按照人们的愿望来改造生物性状 2 没有第二步 目的基因就不能在受体细胞中稳定存在和稳定遗传 更谈不上在受体细胞中表达 3 没有第三步 就不能实现一种生物的基因在另一种生物中转化 4 没有第四步 就不知道目的基因是否真正导入受体细胞 是否真正能够在受体细胞中正确表达 6 目的基因 主要指编码蛋白质的结构基因如 生物抗逆性基因 优良品质基因 与药物和保健品合成有关的基因 与毒物降解相关的基因 也用一些有调控作用的基因如 调控细胞周期的基因 7 获取目的基因的方法一 直接分离基因 鸟枪法 将供体生物的DNA用限制酶切割为许多片段 取出DNA 用限制酶切断DNA 8 目的基因的存储 1 基因组文库 基因文库的概念 2 cDNA文库 将含有某种生物不同的许多DNA片段 导入受体菌的群体中储存 各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因 06 04 2020 9 典例1 2009 天津高考改编 为从根本上解决水稻中的高植酸问题 可将植酸酶基因导入水稻 培育低植酸转基因水稻品种 如图是获取植酸酶基因的流程 06 04 2020 10 据图回答 1 图中基因组文库 小于 等于 大于 cDNA文库 2 B过程需要的酶是 A C过程中 可以 不可以 使用同一种探针筛选含目的基因的菌株 3 目的基因 和 除可从构建的文库中分离外 还可以分别利用图中 和 为模板直接进行PCR扩增 该过程中所用酶的显著特点是 06 04 2020 11 解题关键 解答本题注意以下两点 1 从酵母菌中获取目的基因 酵母菌是真核生物 其基因组文库中存在内含子 然后抓住基因组文库与cDNA文库的区别来解题 2 根据PCR扩增的模板 酶的来源和特点来解题 06 04 2020 12 标准解答 分析获取植酸酶基因的流程图可知 图中基因组文库大于cDNA文库 B过程需要的酶应该是逆转录酶 A C过程虽然都能获得含目的基因的菌株 但C中无内含子对应的序列 所以不可以使用同一种探针进行筛选 目的基因 和 除可从构建的文库中分离外 还可以分别利用图中DNA和cDNA为模板直接进行PCR扩增 该过程中所用酶的显著特点是耐高温 06 04 2020 13 答案 1 大于 2 逆转录酶不可以 3 DNAcDNA耐高温 06 04 2020 14 互动探究 1 结合本题分析 若cDNA文库中缺少某基因 则只用PCR技术扩增能得到该基因吗 提示 不能 PCR技术扩增的实质是模拟DNA分子的复制 若cDNA文库中没有相关基因 即使进行PCR扩增也得不到该基因 2 本题中A C过程都是筛选获取目的基因的过程 请你说出筛选的依据是什么 提示 从基因组文库 cDNA文库等基因文库中可依据基因的有关信息 如基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA及基因的表达产物蛋白质等 获取目的基因 06 04 2020 15 变式训练 下列属于获取目的基因的方法的是 利用mRNA反转录形成 从基因组文库中提取 从受体细胞中提取 利用PCR技术合成 利用DNA转录形成 人工合成A B C D 06 04 2020 16 解析 选D 目的基因可以从基因文库中提取 也可以用mRNA反转录形成DNA的一条链 然后合成DNA分子 对于一些已知一段核苷酸序列的目的基因 可用PCR技术扩增合成 对于一些短小而无模板且已知核苷酸序列的目的基因可用人工合成法 受体细胞是目的基因表达的场所 不能从中提取目的基因 DNA转录出的是RNA 不能得到目的基因 17 逆转录法 以信使RNA为模板 在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成DNA 基因 直接合成法 根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使RNA核苷酸顺序 再据此推算出基因DNA的脱氧核苷酸顺序 用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因 DNA合成仪 人工合成目的基因 前提是什么 获取目的基因的方法二 18 利用PCR技术扩增 快速获取大量目的基因 原理 在体外进行DNA复制 19 讨论 PCR技术扩增DNA和体内DNA复制条件是否可以完全相同 阅读P10相关材料 20 讨论 PCR技术扩增DNA和体内DNA复制条件是否可以完全相同 阅读P10相关材料 21 利用PCR技术扩增 快速获取大量目的基因 1 调温到90 95度 使双链间的氢键打开 变成单链DNA 作为互补链聚合反应的模板 2 调温到55 60度 使两处引物分别与模板DNA链3 端的互补序列互补配对3 调温到70 75度在酶的作用下 将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3 OH上 使DNA链延伸 产生一条与模板链互补的DNA单链 PCR扩增仪 22 基因表达载体的构建 2 构建零件及作用目的基因启动子终止子标记基因 23 目的基因与运载体结合 用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口 将目的基因插入切口处 让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后 在连接酶的作用下连接形成重组DNA分子 提取质粒并用限制酶切割 用连接酶将目的基因和质粒连接 06 04 2020 24 典例2 2011 浙江高考 将ada 腺苷酸脱氨酶基因 通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶 下列叙述错误的是 A 每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒B 每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点C 每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个adaD 每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子 06 04 2020 25 解题关键 解答本题时明确以下两点 1 明确本题中的目的基因是腺苷酸脱氨酶基因 2 牢记质粒作为运载体的条件 其中至少有一个限制性核酸内切酶识别位点 06 04 2020 26 标准解答 选C A项 ada为目的基因 大肠杆菌为受体细胞 将目的基因导入大肠杆菌时如果能成功表达说明每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒 B项 要让目的基因与质粒形成重组质粒 两者必须用同种限制性核酸内切酶切割 所以每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点 06 04 2020 27 C项 质粒作为运载体的条件之一是有多种限制性核酸内切酶的识别位点 但每种限制性核酸内切酶只有一个识别位点 只能插入一个目的基因 ada D项 ada导入大肠杆菌成功的标志是表达腺苷酸脱氨酶 因此每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子 06 04 2020 28 变式训练 下列关于基因表达载体构建的相关叙述 不正确的是 A 需要限制酶和DNA连接酶B 必须在细胞内进行C 抗生素抗性基因可作为标记基因D 启动子位于目的基因的首端 06 04 2020 29 解析 选B 基因表达载体构建是将目的基因与载体结合 在此过程中需用同一种限制酶切割目的基因与载体 用DNA连接酶将相同的末端连接起来 基因表达载体的构建是在细胞外进行的 基因表达载体包括启动子 位于基因首端使转录开始 终止子 目的基因和标记基因 鉴别受体细胞中是否含有目的基因 如抗生素抗性基因 30 将目的基因导入受体细胞 常用方法 1 导入植物细胞的方法 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法2 导入动物细胞的方法 显微注射技术3 导入微生物细胞方法 Ca 处理大肠杆菌 31 将目的基因导入受体细胞并扩增 1 基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌 枯草杆菌 土壤农杆菌和动植物细胞等 2 导入受体细胞常用的方法是借鉴细菌或者病毒侵染细胞的途径 通常还要对一些受体细胞进行增大通透性的处理 3 目的基因可以随着受体细胞进行快速的繁殖 在很短的时间内获得大量的基因 将目的基因导入受体细胞 将受体细胞进行扩增 06 04 2020 32 典例3 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物 能在自然条件下感染植物 因而在植物基因工程中得到了广泛的运用 如图为农杆菌转化法的示意图 试回答下列问题 06 04 2020 33 1 一般情况下农杆菌不能感染的植物是 利用农杆菌自然条件下感染植物的特点 能实现 具体原理是在农杆菌的Ti质粒存在T DNA片段 它具有可转移到受体细胞并整合到受体细胞的 上的特点 因此只要将携带外源基因的DNA片段插入到 部位 即可 2 根据T DNA这一转移特点 猜测该DNA片段上可能含有控制 酶 合成的基因 06 04 2020 34 3 图中c过程中 能促进农杆菌移向植物细胞的物质是 类化合物 4 植物基因工程中将目的基因导入受体细胞的方法除了农杆菌转化法之外 还可采取的方法是 至少写出两种 解题关键 本题解题要点 1 分析农杆菌能感染双子叶植物和裸子植物的本质 2 分析农杆菌中Ti质粒中的T DNA特点及其整合到染色体DNA的实质 06 04 2020 35 标准解答 1 一般农杆菌不能感染的植物是单子叶植物 可感染双子叶植物和裸子植物 利用其感染性 可实现将目的基因导入植物细胞 这里需要特别明确的是真正可转移到受体细胞并整合到受体细胞的染色体上的是农杆菌质粒上的T DNA片段 因此目的基因必须插入到该部位才能导入成功 2 根据T DNA这一转移特点 可以推测出DNA片段上能控制合成DNA连接酶 限制酶才能实现与双子叶植物细胞染色体DNA的整合 06 04 2020 36 3 植物细胞受伤后可产生酚类化合物 促进农杆菌向植物细胞转移 4 植物基因工程中将目的基因导入受体细胞的方法除了农杆菌转化法之外 还有基因枪法和花粉管通道法 06 04 2020 37 答案 1 单子叶植物将目的基因导入到植物细胞染色体DNAT DNA片段 内部 2 DNA连接酶 限制酶 3 酚 4 基因枪法 花粉管通道法 06 04 2020 38 互动探究 1 怎样操作能使农杆菌感染单子叶植物 提示 可在单子叶植物受损处涂加酚类物质 如乙酰丁香酮 来吸引农杆菌 2 根据题干分析 为什么动植物病毒也可作为基因工程的载体 提示 病毒能够侵染正常细胞 有的病毒还能将自己的核酸整合到宿主细胞的染色体上 所以可以作为基因工程的载体 06 04 2020 39 变式训练 用基因工程的方法培育抗虫棉 下列导入目的基因的做法正确的是 将毒素蛋白注射到棉花的受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉花的受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组导入细菌 用该细菌感染棉花体细胞再进行组织培养 将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组 注射到棉花子房中 并进入受精卵A B C D 06 04 2020 40 解析 选C 含有目的基因的DNA片段无论采用何种方法导入受体细胞 均需与载体结合并与相关组件一起构建成表达载体 才能在导入受体细胞后稳定维持和正确表达 41 目的基因的检测和表达 1 检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因2 检测目的基因是否转录出了mRNA3 检测目的基因是否翻译成蛋白质 一 分子水平的检测 二 个体生物学水平的鉴定 06 04 2020 42 典例4 2011 海南高考 回答有关基因工程的问题 1 构建基因工程表达载体时 用不同类型的限制酶切割DNA后 可能产生黏性末端 也可能产生 末端 若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接 则应选择能使二者产生 相同 不同 黏性末端的限制酶 06 04 2020 43 2 利用大肠杆菌生产人胰岛素时 构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等 其中启动子的作用是 在用表达载体转化大肠杆菌时 常用 处理大肠杆菌 以利于表达载体进入 为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA 可用标记的胰岛素基因片段作探针与mRNA杂交 该杂交技术称为 为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成 常用抗原 抗体杂交技术 06 04 2020 44 3 如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞 先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的 中 然后用该农杆菌感染植物细胞 通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的 上 06 04 2020 45 解题关键 本题考查基因工程的基本工具和操作过程 解答本题时应明确以下两点 1 明确基因工程的基本工具中限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用特点 理解载体的结构组成和各组分的作用 2 理解基因工程的操作过程 将目的基因导入受体细胞后还需要进一步检测和鉴定目的基因是否成功表达 06 04 2020 46 标准解答 1 限制酶切割产生两种末端 黏性末端和平末端 若用DNA连接酶连接两个末端 两个末端必须是相同的 2 基因工程检测的方法 检测目的基因是否导入 使用DNA分子杂交技术 检测目的基因是否转录 使用分子杂交技术 检测是否形成蛋白质 使用抗原 抗体杂交技术 3 基因工程的目的是获得稳定遗传的新品种 因此要把目的基因插入到染色体的DNA分子中 06 04 2020 47 答案 1 平相同 2 RNA聚合酶识别和结合的部位Ca2 分子杂交技术蛋白质 3 T DNA染色体DNA 06 04 2020 48 变式训练 为扩大可耕地面积 增加粮食产量 黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注 我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系 1 获得耐盐基因后 构建重组DNA分子所用的限制性核酸内切酶作用于图中的 处 D