化学发光技术

化学发光技术 概念 某些化合物分子吸收化学能后 被激发到激发态 再由激发态返回至基态时 以光量子的形式释放出能量 这种化学反应称为化学发光反应 利用测量化学发光强度对物质进行分析测定的方法称为化学发光分析法 化学发光与其它发光分析的本质区别是体系产生发光 光辐射 所吸收的能量来源不同 化学发光反应两个关键步骤 化学激发和发光 故化学反应要成为发光反应 必须满足两个条件 1 反应必须提供足够的能量 170 300KJ mol 2 这些化学能必须能被某种物质分子吸收而产生电子激发态 并且有足够的光量子产率 发光效率 指发光剂在反应中的发光分子数与参加反应的分子数之比 一般化学发光反应 值约为10 6 常见化学发光剂直接 吖啶酯类三联吡啶钌间接 酶促化学发光剂 辣根过氧化物酶 鲁米诺及其衍生物 碱性磷酸酶 AMPPD 酞箐 二甲基噻吩衍生物等 活性氧 条件 碱性PH8 6催化剂 辣根过氧化物酶 氧化血红素等氧化剂 过氧化氢 高锰酸钾 碘等量子产率 0 05 0 15应用 检测血迹 425nm 470nm 条件 碱性氧化剂 过氧化氢应用 标记半抗原和蛋白质不需要催化剂 优点 背景发光低 干扰因素少 发光效率高 易于蛋白质联接 且不影响自身 三联吡啶钌Ru byp 3 2电化学发光剂 可直接标记抗原抗体 发光剂的常见标记技术1 碳二亚胺缩合反应 酰胺键 2 重氮盐偶联法3 过碘酸钠氧化法 化学发光免疫分析技术CLIA 上世纪70年代中期Arakawe首先报道CLIA是目前发展和推广应用最快的免疫分析方法也是目前最先进的标记免疫测定技术优点 灵敏度高 特异性强 试剂价格低廉 试剂稳定且有效期 6 18个月 方法稳定快速 检测范围宽 操作简单自动化程度高等 化学发光免疫分析 CLIA 是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合 应用于各种抗原 半抗原 抗体 激素 酶 脂肪酸 维生素和药物等的检测分析技术 是继放免分析 酶免分析 荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术 固相分离 板 过滤分离 膜 珠式分离 固相分离 材质 聚苯乙烯珠子 顺磁性颗粒分离 固相分离 材质 内含三氧化二铁的聚苯乙烯的小颗粒 首选 化学发光免疫分析包括 直接化学发光免疫分析化学发光酶联免疫分析电化学发光免疫分析 直接化学发光免疫分析 用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法 吖啶酯类 化学发光酶免疫分析 CLEIA 属酶免疫分析 只是酶反应的底物是发光剂 操作步骤与酶免分析完全相同 以酶标记生物活性物质进行免疫反应 免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物 在信号试剂作用下发光 用发光信号测定仪进行发光测定 目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶 HRP 和碱性磷酸酶 ALP 它们有各自的发光底物 特点 1 属酶免疫测定范畴2 酶标记抗原或抗体结合稳定3 酶催化鲁米诺 AMPPD等发光剂发出的光稳定 持续时间长 便于记录和测定 电化学发光免疫分析 ECL 是指由电化学反应引起的化学发光过程 反应在电极表面进行 发光底物为三联吡啶钌 Ru byp 3 2 三丙胺 TPA 用来激发光反应 在阳极表面 两种物质同时失去电子 这一过程在电极表面反复进行 产生高效 稳定的连续发光 并不断增强 特点 1 三联吡啶钌在电场中因不断得到三丙胺提供的电子 故发光持续时间长 信号强度稳定2 三联吡啶钌可直接标记抗原或者抗体 不影响标记物的理化性质3 试剂灵敏度高 稳定性好 化学发光免疫分析仪包含 免疫反应系统和化学发光分析系统 化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化 形成一个激发态的中间体 当这种激发态中间体回到稳定的基态时 同时发射出光子 hM 利用发光信号测量仪器测量光量子产额 免疫反应系统是将发光物质 在反应剂激发下生成激发态中间体 直接标记在抗原 化学发光免疫分析 或抗体 免疫化学发光分析 上 或酶作用于发光底物 仪器系统组成及工作原理1 产品结构化学发光免疫分析仪 由检测系统 光电系统 计算机系统和打印机系统组成 2 工作原理化学发光免疫分析仪是将血清样本