水曲柳复壮机理的研究11月份总结

组织培养过程中水曲柳复壮机理的研究 任小龙 1 构建水曲柳抑制消减文库 SSH 2 基因克隆3 基因的转化和功能预测 MRNA的提取 分离提纯 依照说明书进行 SSH具体操作依照说明书进行 差减cDNA文库的构建 差示筛选差减DNA文库 Northern杂交分析 cDNA片段的测序和DNA序列分析 相关基因的克隆 转化 总RNA的提取与mRNA的分离纯化 构建水曲柳抑制消减文库 1构建目的 分离两个mRNA群体间差异表达基因 2 构建方法 1接头Tester 过量Driver第一次杂交Driver二次杂交2接头 2RNA2cDNA2cDNA片段 1接头2接头 Driver 酶切 过量Tester第一次杂交Tester二次杂交 差异表达cDNA大量富集 克隆转化 建立文库 抑制性差减杂交PCR法 SSH 1 第1次杂交 提取TS和RS的mRNA反转录为testercDNA和drivercDNA 用RsaI或Hae 酶切成平头末端cDNA 分成均等2份 分别加不同的接头 再分别与过量的drivercDNA杂交 将形成4种产物 a 单链testercDNA b 自身退火的tester tester双链 c 异源退火tester driver双链 d drivercDNA 2 第2次杂交 合并2份杂交产物 加入新的变性drivercDNA退火 杂交 这次除了a b c d4种产物外还形成产物e e是tester自身退火形成 但两端带不同接头 3 特异性片段的扩增 末端补平后 先后加接头的内 外侧引物扩增 a和d无扩增 b由于两端接头互补形成发夹结构也无扩增 c仅一端有引物结合呈线性扩增 仅e两端可配不同引物而呈指数扩增 4 特异性片段e克隆 并进一步分离差异表达基因 该法通过2次杂交和2次PCR 使假阳性率降到6 且灵敏度高 用SSH可一次同时分离几十至几百个差异基因 使效率大增 但由于SSH需mRNA量大 几微克 对mRNA来源困难的材料不利 因为SSH对不同材料或材料间存在小片段缺失不能有效检测 所以研究材料的差异不能太大 SSH主要集中在肿瘤基因的克隆上 也有用于细胞凋亡研究的 1 水曲柳生理成熟态与生理幼态抑制消减杂交文库 SSH 的构建和测序分别取两种不同材料 提取RNA并反转录成cDNA 利用RsaI对cDNA进行酶切 产生平末端cDNA片段 将TestercDNA片段平均分成两份 分别加上不同的接头 用过量的Driver样品分别与两份加了不同接头的Tester样品进行第一次消减杂交 将两组杂交样品混合 同时追加新的变性的DrivercDNA酶切产物 进行第二次消减杂交 进一步富集差异表达cDNA片段 再利用第一次和第二次特异引物PCR提高产物特异性 并使差异表达cDNA大量富集 最后进行克隆转化 建立文库 差减cDNA文库的构建 从ssH的PcR扩增后的正向差减cDNA群体中取出3ul与载体连接 4 过夜 从连接体系中取2ul转化受体菌于的琼脂平板上挑取白色菌落 重组子 点种于盛有液体LB培养基的96孔板中 37 培养夜后一70 c保种 差示筛选差减DNA文库 Northern杂交分析 取抽提的H和M总RNA甲醛凝胶电泳 转膜 1 挑取与4种探针杂交信号强度相近的克隆经PcR扩增后用放射性同位素标记探针 与M和H总RNA进Northern杂交 以确证M和H总RNA电泳上样量是否相同 2 随机挑取8个复筛的DNA重组r 通过PcR扩增外源插入片段 同收插入片段并标记 分别做Northern杂交 cDNA片段的测序和DNA序列分析 阳性重组克隆采用自动测序法测序 用BLAsrl软件搜索Gcn Bank中同源序列进行比较 2 基因克隆 1图位克隆技术 2转座子或TDNA标签 3同源序列法 4表达序列标签法 5差异表达基因的分离方法 基因克隆万方文库 3 基因的转化和功能预测 基因转化万方文库 原理简介 运用已克隆的目的基因构建植物超表达载体 将目的基因插入带有启动子和终止子的表达载体中 酶切鉴定表明 目的基因已正确地插入载体中 用根癌农杆菌介导法将其转入烟草中 共获得带有目的基因的烟草幼苗 对其植株进行PCR检测 全都扩增出目的条带 进一步对这些株进行Southern杂交检测和RT PCR检测 发现株系均有杂交带出