实验四 考马斯亮蓝方法和BCA法

实验四 蛋白质的定量测定考马斯亮蓝法 Bradford 和BCA法 实验目的及要求 了解考马斯亮蓝法 Bradford法 和BCA法的原理及干扰因素掌握标准曲线法测定蛋白质含量的方法 蛋白质检测及含量的测定 一 化学检测1 凯氏定氮法 Kjeldahl 0 2 1 0mg ml 平均含氮量16 2 双缩脲法 Biuret 1 10mg ml 肽键在碱性溶液中与铜离子络合呈紫红色 3 Folin 酚试剂法 Lowry 20 250mg ml 干扰因素多 4 考马斯亮蓝法 Bradford 10 100mg ml 受蛋白质内氨基酸组成影响较大 5 BCA法 bicinchoninicacid二喹林甲酸 5 200mg ml MicroBCA 0 5 20mg ml 二 光学检测1 荧光检测 邻苯二甲醛 OPT 法 强还原剂与氨基酸 肽反应产生强荧光性化合物 激发波长为340nm 荧光波长为455nm 可用于氨基酸自动分析系统 2 紫外光检测 10mg ml 芳香族氨基酸残基对280nm的紫外光有最大吸收 三 电泳或免疫化学检测 如PAGE WesternBlot ELISA等 考马斯亮蓝G250 CoomassiaBrilliantBlueG 250 能在酸性溶液中与蛋白质的疏水区结合 最大光吸收峰从405nm变为595nm 溶液的颜色也从棕黑色变为蓝色 所显示蓝色至少在1小时内是稳定的 在一定浓度范围内 复合物的光密度与蛋白质含量呈线性关系 Bradford法原理 优点 灵敏度高 0 100 g ml 测定快速 简便 颜色可以在1小时内保持稳定 干扰物质少 缺点 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同 因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差 去污剂 甘油 乙酸和0 1M的NaOH会干扰此法的测定 BCA法原理 BCA 2 2 联喹啉 4 4 二甲酸二钠 Bicinchoninicacid 能与含二价铜离子的硫酸铜组成BCA工作试剂 在碱性条件下 二价铜离子可以被蛋白质还原成一价铜离子 一价铜离子与BCA相互作用 两分子的BCA螯合一个铜离子 形成紫色复合物 在562nm处显示强吸光性 在一定浓度范围内 复合物的光密度与蛋白质含量呈线性关系 优点 准确灵敏 5 200 g ml 测定快速简便 经济实用 干扰物质少 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于Bradford法缺点 与荧光蛋白质定量等方法相比 属于化学呈色法的BCA法检测灵敏度尚不够 蔗糖 尿素 NH4 和EDTA影响测定结果 每种蛋白质测定法各有其优缺点 在选择方法时应考虑的因素 实验对测定所要求的灵敏度和精确度 蛋白质的性质 溶液中存在的干扰物质 测定所要花费的时间 实验内容 1 制备蛋白样品 2 分别制作两种测定方法的标准曲线 3 分别用两种方法测定样品 实验流程 1制备总蛋白样品 小白菜 梗 叶 10g 碾成匀浆 加水10ml后继续碾10min 倒入离心管中 另加20ml水将剩余物洗入两个50ml离心管 称重平衡后10000r min离心10min 小心地将少量上清 约15 20ml 倒入小烧杯 取烧杯中上清10ml定容到100ml 待测 用量筒量取剩余上清的体积 计算上清总体积 Bradford法实验表格 X Y 1ml 10 100mg ml C为未知浓度蛋白质溶液 BCA法实验表格 X Y 1ml 5 200mg ml C为未知浓度蛋白质溶液 注意 1 自己制备的蛋白质溶液测定含量时 注意稀释度控制在测定范围内2 蛋白质样品和呈色剂都不应有沉淀 有沉淀应过滤除去3 染料与蛋白质结合后 形成的蓝色复合物易轻度沾附试管壁或比色皿 每次使用不能用有着色的比色皿 使用完后应立即用95 乙醇清洗干净 标准曲线的制作 蛋白质标准曲线 0 0 02 0 04 0 06 0 08 0 1 0 12 0 14 0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 1 2 浓度 mg ml 吸光值 A562 1 比较两种方法测得的小白菜中蛋白质的含量 单位 mg ml 说明有什么不同