第三章蛋白质的化学(一)

第三章蛋白质的化学 一 氨基酸的结构与性质 海洋学院制药工程系齐兴柱 本章的主要内容 1 蛋白质的概述2 氨基酸的结构和分类3 氨基酸的理化性质4 氨基酸的分离方法 一 蛋白质在生物体内的含量 化学组成及分类 第一节蛋白质的概述 一 蛋白质在生物体内的含量 生物体内的蛋白质是除水以外 机体组织中最多的组分 占人体干重的45 占细菌干重的50 70 水 80 90 蛋白质 7 10 其它物质 1 2 细胞的化学组成 二 蛋白质的元素组成 蛋白质是有机化合物 离不开C H O三种元素 还含有N P S 金属元素等 蛋白质中N是特征元素 且含量恒定 为16 左右 即16克氮 100克蛋白质 故可以用定氮法测量蛋白质含量 即 每100克蛋白质含氮16克 100 16 6 25克蛋白质含氮1克 所以 每100克样品含氮量 6 25 100克样品蛋白质含量 克 有些蛋白质含有其他微量元素 P Fe Cu Mn Zn Co Mo I等 某细胞蛋白质粗提物0 5g 经定氮法检测含氮67mg 试问该蛋白粗提物的蛋白质含量是多少 1 根据分子形状和溶解度分 球状蛋白质 globularproteins 纤维状蛋白质 Fibrousproteins 和膜蛋白球状蛋白多肽链紧密折叠 轮廓上象一个球型的大分子 典型特征是 它有一个疏水的内部环境和一个亲水的表面 纤维蛋白的主要功能是维持和支撑单个的细胞和整个的有机体 角蛋白和胶原蛋白是最常见的纤维蛋白 角蛋白是毛发和动物尾巴的主要成分 而胶原蛋白是腱 皮肤 骨骼和牙齿的主要蛋白成分 2 根据功能分 活性蛋白质 结构蛋白质 3 根据组成分 1 简单蛋白质 清蛋白 球蛋白 谷蛋白 醇溶谷蛋白 组蛋白 精蛋白 硬蛋白 2 结合蛋白质 色素蛋白 金属蛋白 磷蛋白 核蛋白 脂蛋白 糖蛋白 三 蛋白质的分类 二 蛋白质的生物学功能多样 1 作为生物催化剂 2 调节代谢反应 3 运输载体 4 参与机体的运动 5 参与机体的防御 6 接受传递信息 7 调节或控制细胞的生长 分化 遗传信息的表达 8 其它 所以 我们说蛋白质是构成生命活动的物质基础 没有蛋白质就没有生命 生物体内氨基酸有180多种 组成蛋白质的氨基酸只有20种 都是 氨基酸 氨基酸 碳 分子中第2个碳 C 结合着一个氨基和一个酸性的羧基 此外C 还结合着一个H原子和一个侧链基团 用R表示 每一种氨基酸的R都是不同的 侧链上的碳依次按字母命名为 和 碳 分别指的是第3 4 5和6位碳 第二节氨基酸的结构和分类 一 氨基酸的结构通式及其构型 氨基酸的结构通式 3 各种氨基酸的区别在于侧链R基上 4 构成蛋白质的氨基酸均为L 氨基酸 5 严格的说 脯氨酸不是氨基酸 而是亚氨基酸 二 氨基酸的构型 构成蛋白质的氨基酸除甘氨酸外 其 碳原子均为手性碳原子 因此具有旋光性 以C 为中心 空间各原子有两种排列方式 L 构型与D 构型 它们的关系就像左右手的关系 互为镜像关系 下图以丙氨酸为例 脯氨酸 三 20种氨基酸的分类 极性氨基酸 非极性氨基酸 极性不带电荷氨基酸 带负电荷氨基酸 带正电荷氨基酸 2 按R基的极性性质 可以将20种氨基酸进行如下分类 在PH7时 1 按R基的组成可分为 脂肪族氨基酸 芳香族氨基酸 杂环氨基酸 含硫氨基酸 氨基酸按其R基的极性分类 在PH7时 Ala A 丙氨酸 组成蛋白质的20种氨基酸的化学结构式及其缩写符号 非极性氨基酸 Val Leu V L 缬氨酸 亮氨酸 Ile I 异亮氨酸 Pro P 脯氨酸 亚氨基酸 Phe F 苯丙氨酸 Trp W 色氨酸 Met M 甲硫氨酸 蛋氨酸 丝氨酸 Ser S Asn Thr T N 苏氨酸 天冬酰胺 极性不带电荷氨基酸 Gly G 甘氨酸 有时也划分为非极性氨基酸 Gln Q 谷氨酰胺 Tyr Y 酪氨酸 Cys C 半胱氨酸 Asp D 天冬氨酸 极性带负电荷氨基酸 酸性氨基酸 Glu E 谷氨酸 His H 组氨酸 极性带正电荷氨基酸 碱性氨基酸 Lys Arg K R 赖氨酸 精氨酸 一 物理性质 1 形态 均为白色结晶或粉末 不同氨基酸的晶型结构不同 2 溶解性 一般都溶于水 不溶或微溶于醇 在稀酸和稀碱中溶解性好 3 旋光性 除甘氨酸外的氨基酸均有旋光性 第三节氨基酸的理化性质和等电点 宁波市镇海科瑞生物工程有限公司 NingboCreateBiologicalProjectCo Ltd 生产的缬氨酸 4 光吸收 氨基酸在可见光范围内无光吸收 在近紫外区含苯环氨基酸有光的吸收 芳香族即含苯环氨基酸在近紫外区的光吸收 因此可利用此特性用分光光度法测定样品中蛋白质的含量 二 化学性质 1 氨基酸的两性电离及等电点 在生理条件下 pH7附近 氨基酸的氨基质子化 NH3 即接受H 而羧基离子化 COO 即电离出H 所以氨基酸具有酸碱两性性质 通常情况下 氨基酸以两性离子的形式存在 如下图所示 两性离子氨基酸溶解于水时 其正负离子都能解离 但解离度与溶液PH值有关 1 向氨基酸溶液加酸时 其两性离子的 COO 负离子接受质子 自身成为正离子 在电场中向阴极移动2 向氨基酸溶液加碱时 其两性离子的 NH3正离子解离放出质子 与OH 结合生成水 自身成为负离子 在电场中向阳极移动3 调节氨基酸溶液PH值 使氨基酸溶液中的氨基和羧基的解离度完全相等 即氨基酸所带静电荷为0 在电场中既不向阴极移动 也不向阳极移动 此时 氨基酸溶液的PH值称为该氨基酸的等电点 以符号PI表示 OH H 电离方程式 在晶体状态或水溶液中的氨基酸 在碱性溶液中的氨基酸 在酸性溶液中的氨基酸 氨基酸所带电荷及等电点对溶解度的影响 1 由于静电作用 在等电点时 氨基酸的溶解度最小 容易沉淀 2 当氨基酸溶液的PH值PI时 溶液中氨基酸带负电 OH OH H H H H K1 H H K2 OH 根据Bronsted Lowry的酸碱质子理论 酸是质子 H 的供体 碱是质子的受体 酸碱的相互关系如下 HAA H 酸碱质子 H H K1 Henderson Hasselbalch方程 亨德森 哈塞尔巴尔赫方程 由于具有两性电离的性质 所以氨基酸的水溶液既可被酸滴定 又可被碱滴定 现以甘氨酸为例来说明氨基酸两性电离的特点 左图是甘氨酸的电离酸碱滴定曲线 左端是用盐酸滴定的曲线 溶液的pH逐渐降低 曲线中从左向右第一个拐点是氨基酸羧基解离50 的状态 即一半甘氨酸成为阳离子 第二个拐点是氨基酸的等电点 右端是用NaOH滴定的曲线 溶液的pH逐渐升高 第三个拐点是氨基酸氨基解离50 的状态 即一半甘氨酸成为阴离子 H K1 阳离子 R 兼性离子 R0 曲线中从左向右第一个拐点是氨基酸羧基解离50 的状态 所以 R0 R 则K1 H 即pK1 pH 按酸碱质子理论 酸是质子供体 碱是质子受体 中性氨基酸完全质子化时 可以看作二元酸 H OH H2O 曲线中从左向右第二个拐点是氨基酸氨基解离50 的状态 所以 R0 R 则K2 H 即pK2 pH K2 C H2N H COO H H 阴离子 R 兼性离子 R0 H OH H2O 利用酸碱质子理论和氨基酸的滴定曲线 科学家推导出了Henderson Hasselbalch方程 亨德森 哈塞尔巴尔赫方程 利用该方程可求出 1 在任一pH条件下一种氨基酸各种离子的比例 2 各解离基团的解离常数 pK 再由 pK 值的大小确定 pK 代表哪个基团的解离 例1 用HCl和NaOH中的一种滴定处于两性离子状态的甘氨酸 现测得甘氨酸两性离子与甘氨酸阳离子的浓度比例为10 1 并测得此时溶液pH值为1 34 1 求甘氨酸某基团的解离常数 2 并说明滴定是用的HCl还是NaOH 3 所求的是甘氨酸哪个基团的解离常数 例2 用HCl和NaOH中的一种滴定处于两性离子状态的甘氨酸 现测得甘氨酸两性离子与甘氨酸阴离子的浓度比例为1 1 已知甘氨酸的解离常数K1 1 0 10 2 34 K2 1 0 10 9 60 K1表示 COOH的解离常数 K2表示NH3 的解离常数 1 并说明滴定是用的HCl还是NaOH 2 求此时溶液pH值的是多少 1 中性氨基酸 氨基酸等电点的计算 pI pK 1 pK 2 2 pK 1为 羧基的解离常数 pK 2为 氨基的解离常数 以丙氨酸为例 Ala Ala Ala Ala 根据质量作用定律 K1 K2 Ala H Ala Ala H Ala K1 Ala H Ala H Ala K2 Ala 当达到等电点时 Ala Ala 所以 K1 Ala H H Ala K2 K1 K2 H 2 方程两边取负对数得 pK1 pK2 2pH 而这里 PH就是PI pI pK1 pK2 2 对侧链R基不解离的中性氨基酸来说 其等电点是它的pKl和pK2的算术平均值 对多氨基和多羧基氨基酸的解离解离原则 2 酸性氨基酸 Asp Asp Asp Asp 天冬氨酸等电点时为 Asp pI pK1 pK2 2 以天冬氨酸为例 天冬氨酸的解离方程为 3 碱性氨基酸 Lys Lys Lys Lys 以赖氨酸为例 赖氨酸的解离方程为 赖氨酸等电点时为 pI pK2 pK3 2 Lys 由于羧基的解离度大于氨基的解离度 所以中性氨基酸的PI点都在PH6 0左右 酸性氨基酸的PI点小于4 0 碱性氨基酸的PI点大于7 0 20种氨基酸在25 时pK和pI的近似值 表1 20种氨基酸在25 时pK和pI的近似值 表1 其中半胱氨酸是30 测定数值 中性氨基酸 pK1 为 羧基的解离常数 pK2 为 氨基的解离常数 pI pK1 pK2 2酸性氨基酸 pK1 为 羧基的解离常数 pK2 为侧链羧基的解离常数 pI pK1 pK2 2碱性氨基酸 pK2 为 氨基的解离常数 pK3 为侧链氨基的解离常数 pI pK2 pK3 2 总结 1 某氨基酸的等电点即为该氨基酸两性离子两边的pK值和的一半 2 在氨基酸等电点以上任何pH AA带净的负电荷 在电场中向阳极移动 在氨基酸等电点以下任何pH AA带净的正电荷 在电场中向阴极移动 3 在一定pH范围中 溶液的pH离AA等电点愈远 AA带净电荷愈多 小结 二 氨基酸的重要化学反应 与亚硝酸反应氨基酸与茚三酮 ninhydrin 反应 检测和定量氨基酸和蛋白质的重要反应氨基酸与2 4 二硝基氟苯 DNFB Sanger试剂 反应氨基酸与丹磺酰氯的反应氨基酸与苯异硫氰酸酯反应 1 与亚硝酸反应 放出氮气 氮气的一半来自氨基氮 一半来自亚硝酸 在通常情况下测定生成的氮气的体积量可计算氨基酸的量 此反应可用于测定蛋白质的水解程度 是凯氏定氮法的理论基础 说明 1 脯氨酸不能与亚硝酸反应2 NH2作用3 4min即反应完全 而R基上NH2反应速度较慢 凯氏定氮法的普遍适用性 精确性和可重复性已经得到了国际的广泛认可 它已经被确定为检测食品中蛋白质含量的标准方法 但是 这种方法并不能给出真实的蛋白质含量 因为所测定的氮可能不仅仅是由蛋白质转化来的 这可以从2007年美国宠物食品污染事件和2008年中国毒奶粉事件等食品安全事件中被体现 三聚氰胺 一种含氮量较高的物质 被添加到了食品中以伪造较高的含氮量 另外 由于不同的氨基酸序列 这种方法也需要许多不同的校正因子 三聚氰胺分子结构式 2 与茚三酮反应茚三酮在弱酸性溶液中与 氨基酸共热 氨基酸被氧化成醛 CO2和NH3 最后茚三酮与反应产物 氨和还原茚三酮发生作用 生成蓝紫色化合物 两个亚氨基酸 脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应形成黄色化合物 茚三酮 水合茚三酮 用途 用于氨基酸的定性定量分析 氨基酸与茚三酮反应 水合性茚三酮 3 与2 4 二硝基氟苯 2 4 DNFB 的反应 Sanger反应 4 与苯异硫氰酸酯 PITC 反应 Edman反应 生成苯乙内酰硫脲 氨基酸 5 与丹磺酰氯 DNS Cl 的反应 生成荧光物质DNS 氨基酸 3 4 5 反应用于蛋白质的N 末端的测定 3 与2 4 二硝基氟苯 2 4 DNFB 的反应 Sanger反应 在弱碱性溶液中 氨基酸的 氨基很容易与2 4 二硝基氟苯 DNFB 作用 生成稳定的黄色2 4 二硝基苯基氨基酸 简写为DNP 氨基酸 DNFB dinitrofiuorobenzene 氨基酸 DNP AA 黄色 HF 4 与丹磺酰氯反应 DNS 丹磺酰氯是二甲氨基萘磺酰氯的简称 HCI 有荧光 5 与苯异硫氰酸酯 PITC 的反应 Edman反应 在弱碱性条件下 氨基酸中的 氨基还可以与苯异硫氰酸酯 PITC 反应 产生相应的苯氨基硫甲酰氨基酸 PTC 氨基酸 在无水酸中 PTC 氨基酸即环化为苯硫乙内酰脲 PTH 后者在酸中极稳定 这个反应首先被Edman用于鉴定多肽或蛋白质的N 末端氨基酸 PITC 苯硫乙内酰脲 PTH AA 苯氨基硫甲酰氨基酸 PTC 氨基酸 Edman反应 CH3NO2 第四节氨基酸混合物的分析分离 分离氨基酸的方法主要有 特殊试剂沉淀法 溶解度法 等电点沉淀法 层析法等 一 等电点沉淀法 对于等电点差异较大的氨基酸混合物 通过调节溶液的PH值 使其中的某种氨基酸达到等电点 溶解度最低 从而结晶沉淀出来 达到分离的目的 二 层析法 层析法是利用被分离样品混合物中各组分的化学性质的差异 使各组分以不同程度分布在两个相中 这两个相一个为固定相 另一个为流动相 当流动相流进固定相时 由于各组分在两相中的分配情况