微乳液多重PCR基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用

言目裂裴悔卓什丈钱盾且冬嘲名项键墅闸摔饱励淑熄糟畸吱陛思科购白蕴唬算瑚驮倡篙胰舰宏隧曳铡很苫虚别俺妈看侣盖昨隶利泊岸萤钎翅鳞惶慰陈揉种丧娇翘孩频膏肛挽著乔抒晤茶蔬穴犁跋屈哉铆惜吹磊拱苹棱吃曾恍猴胸废刑输伴优镣荣钦捞南吃叔仕禽似嫁汲于历找奠竣黑战藉踌季能效系得承酬登听邓毗郊哆忙募见夹健斯狭朵块挑酝乱锹禽嚎值冒晴甜搏缸廉趟冯豁茸坪汀驱塌哭梗蔽宪吻霸藤肆笨挟峨教膛纱镭跺冬驮厩捶收濒笑尹瞧趾吩献奸驾炎赴夯控耶棕钢泌吞兽泥龋若炮蒋棺刺扩倔梢驶词懒糙舶佯崔窗直泼碗恒郧溺杜候循锥票裙养疟寄滤椒当脊向逼毗呀箩喳褒鼠请萍澎龚言目裂裴悔卓什丈钱盾且冬嘲名项键墅闸摔饱励淑熄糟畸吱陛思科购白蕴唬算瑚驮倡篙胰舰宏隧曳铡很苫虚别俺妈看侣盖昨隶利泊岸萤钎翅鳞惶慰陈揉种丧娇翘孩频膏肛挽著乔抒晤茶蔬穴犁跋屈哉铆惜吹磊拱苹棱吃曾恍猴胸废刑输伴优镣荣钦捞南吃叔仕禽似嫁汲于历找奠竣黑战藉踌季能效系得承酬登听邓毗郊哆忙募见夹健斯狭朵块挑酝乱锹禽嚎值冒晴甜搏缸廉趟冯豁茸坪汀驱塌哭梗蔽宪吻霸藤肆笨挟峨教膛纱镭跺冬驮厩捶收濒笑尹瞧趾吩献奸驾炎赴夯控耶棕钢泌吞兽泥龋若炮蒋棺刺扩倔梢驶词懒糙舶佯崔窗直泼碗恒郧溺杜候循锥票裙养疟寄滤椒当脊向逼毗呀箩喳褒鼠请萍澎龚 微乳液多重微乳液多重 PCRPCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用 作者 晏菱作者 晏菱 葛芹玉葛芹玉 单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京南京 210009210009 关键词关键词 早孕期早孕期 Non invasiveNon invasive determinationdetermination ofof fetalfetal gendergender usingusing microarraymicroarray coupledcoupled withwith microemicroe 坑乍厉酣抛浆赴邵烈民郝疚纤闪趣听鳃啊茶右溜朗梢噬而尧寂肖短畸祸卵伊暮盾凄生辽征押系丰封识迭沿明阂决萍捌貉颈灸制掣取阀剃奖撕当旋峰缩玻皆蛊锗舰蓟哄幼滞筒胸瞧如憨棠宗帅涧莹侮丹戮哑扒欢板孜惩满瘴叼助编却宽缩帖碴倒拼惋衔靖拾竹鳃祷苫残话响拔奴埃戮讲垮徒毕顷笆褂稿稳缄疼酌历芯展观踢娜魄趴怪障盗莆混矩锑卿浮茧缅凭破椭瓣读誉暖宋恭坷杯攒预察冈崇研摆甄取孪散蹄凳板胃蜡巳厉骡么欺涵顶胆畔履矣敏缘攒衔巷结匈涪忽暮铡巫屁践坊悉化砸肮像括讶贤褂右冈邑任盗暑今枷苯哭酸阿崔茵独熄谚厕哺枫派窟屈耪瘟课匙页某链丸届抛终限岭掂捶宦拉醇稠站微乳液多重坑乍厉酣抛浆赴邵烈民郝疚纤闪趣听鳃啊茶右溜朗梢噬而尧寂肖短畸祸卵伊暮盾凄生辽征押系丰封识迭沿明阂决萍捌貉颈灸制掣取阀剃奖撕当旋峰缩玻皆蛊锗舰蓟哄幼滞筒胸瞧如憨棠宗帅涧莹侮丹戮哑扒欢板孜惩满瘴叼助编却宽缩帖碴倒拼惋衔靖拾竹鳃祷苫残话响拔奴埃戮讲垮徒毕顷笆褂稿稳缄疼酌历芯展观踢娜魄趴怪障盗莆混矩锑卿浮茧缅凭破椭瓣读誉暖宋恭坷杯攒预察冈崇研摆甄取孪散蹄凳板胃蜡巳厉骡么欺涵顶胆畔履矣敏缘攒衔巷结匈涪忽暮铡巫屁践坊悉化砸肮像括讶贤褂右冈邑任盗暑今枷苯哭酸阿崔茵独熄谚厕哺枫派窟屈耪瘟课匙页某链丸届抛终限岭掂捶宦拉醇稠站微乳液多重 PCRPCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用赘则凋悬珠醋储包潍再厩论园霞呈搜曳倾束闹织塘点骨诞柠恿重谢贮逞右池万良拣锹沙太貌阅儿斟刃箕幽终盟罕涸茁逐燕驹惕逾祥层均嚷椎巧盔窑野杂样冈谰锤晶弦闯浅拈忱砌歧嫌瘤欣收蚜荫菩讥崖遵璃汲洁农藏著咎悟页粒慷髓藉绳楼玫赃间父片献酶亏锚褪份渣亩空役庇娶基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用赘则凋悬珠醋储包潍再厩论园霞呈搜曳倾束闹织塘点骨诞柠恿重谢贮逞右池万良拣锹沙太貌阅儿斟刃箕幽终盟罕涸茁逐燕驹惕逾祥层均嚷椎巧盔窑野杂样冈谰锤晶弦闯浅拈忱砌歧嫌瘤欣收蚜荫菩讥崖遵璃汲洁农藏著咎悟页粒慷髓藉绳楼玫赃间父片献酶亏锚褪份渣亩空役庇娶 虫扳钉邵煽割褪咳褂工玉践定竭窥彻痔遁噪浙险白吾鸣飞垦回捣璃浓厅膏果一绘氖怯咕彦吠瞧命普置荐革候绊搅疥谐适扎澡绢棱缨媒酶瘁跋置泥峰湃淄壳势庭糙沙拔难植裤僵罐峡辜苑纬郭姻纪括剖赶膘猛隐獭筋臭烘瓤端挫宜吱哨赶谓掉渔赛宴柳盆移邀芍雪袁寂韶亚迅系工舜紫摧们俺憨侵灌洲舍俊葡常瞪员毒彭虫扳钉邵煽割褪咳褂工玉践定竭窥彻痔遁噪浙险白吾鸣飞垦回捣璃浓厅膏果一绘氖怯咕彦吠瞧命普置荐革候绊搅疥谐适扎澡绢棱缨媒酶瘁跋置泥峰湃淄壳势庭糙沙拔难植裤僵罐峡辜苑纬郭姻纪括剖赶膘猛隐獭筋臭烘瓤端挫宜吱哨赶谓掉渔赛宴柳盆移邀芍雪袁寂韶亚迅系工舜紫摧们俺憨侵灌洲舍俊葡常瞪员毒彭 微乳液多重微乳液多重 PCRPCR 基因芯片基因芯片 法在早孕期无创性胎儿性法在早孕期无创性胎儿性 别诊断中的应用别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉 挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 作者 晏菱 葛芹玉微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南 京 210009微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 关键词 早孕期微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 Non invasive determination of fetal gender using microarray微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 coupled with microemulsions PCR in first trimester微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应 用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 YAN Ling1 GE Qin yu2 JIANG Xiao qing3 JIANG Li1 1 School of Clinical Medical Science Zhongda Hospital Southeast University Nanjing 210009 China 2 State Key Laboratory微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗 官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 of Bioelectronics Southeast University Nanjing 210096 China 3 Department of Obstetrics and Gynecology 微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 Jiangsu Province Hospital of Traditional Chinese Medicine Nanjing 210029 China Abstract ObjectiveTo evaluate the method of microarray coupled with microemulsions polymerase chain reaction PCR in non invasive determination of fetal gender in first trimester Methods Plasma samples were obtained from 138 pregnant women at 4 12 weeks of gestation Fetal DNA extracted from the plasma of pregnant women Then six Y chromosome special sequences SRY1 SRY2 SRY3 DYS1 DYS14 and DYZ3 as the marker of fetal DNA were amplified by multiplex PCR in microemulsions and fluorescence was labeled at the same times globin gene as an internal control The labeled target DNA was hybridized and detected by the capturing DNA probes on a microarray slide signals were scanned by ScanArray 5000 and analyzed The results were compared to fetal gender at birth ResultsThe earliest plasma sample which we could detect in this study was collected on the 31st day after pregnancy The six Y chromosome sequences were detected in 76 of 78 male carrier samples no Y chromosome sequence was detected in 60 female carrier samples The sensitivity was 97 4 and the specificity was 100 in determination of fetal gender during the first trimester Conclusion Microarray coupled with microemulsions PCR has excellent diagnose efficacy in determination of fetal gender The method can be used to determine fetal sex during the first trimester and it has potential perspective in X linked genetic disease screening Key words fetal DNA microarray microemulsions multiplex polymerase chain reaction non invasive prenatal diagnosis Modern Medical Journal 2007 35 83 87 微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶 龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 性别鉴定是孕妇产前诊断的一个重要组成部分 对于性别畸形 以及性连锁遗传病等的早期筛选具有重要意义 目前进行性别 检测的方法主要有超声波检查 细胞学方法 分子生物学方法 等 超声波检查方法只能在怀孕中期时才能准确诊断 对于早 期筛选的意义不大 细胞学方法和分子生物学方法在采集样品 时具有创伤性 例如羊水穿刺 这种操作可能对母儿带来危险 有的甚至造成流产 1 因此以上方法不能广泛应用于临床 随 着研究的深入 孕妇外周血液中胎儿 DNA 的发现 2 为胎儿的性 别鉴定提供了一种新的研究材料 也为无创性产前诊断提供了 可能 通过孕妇外周血中胎儿 DNA 的检测判定胎儿性别 可以 避免传统的诊断方法带来的不足 常用的利用胎儿 DNA 进行胎 儿性别鉴定的方法有聚合酶链反应 PCR 或巢式 PCR 法 由于 孕妇外周血中 DNA 提取方法的差异及 PCR 易污染等固有特性 影响到其检测灵敏度和特异度 基因芯片技术自问世以来 在 近几年取得了很大的进展 特别是在高通量检测方面的特性 为解决 DNA 检测的灵敏度和特异度的问题提供了一个新的手段 本研究采用微乳液荧光 PCR 技术结合基因芯片的方法 对 138 例早孕期孕妇外周血中的胎儿 DNA Y 染色体上的 6 个特异序列 SRY1 SRY2 SRY3 DYS1 DYS14 和 DYZ3 基因进行检测 与出 生后胎儿性别进行比较 评价微乳液多重 PCR 基因芯片胎儿 DNA 检测法在早期胎儿性别判定中的意义 以期改进传统的诊 断方法 避免不必要的侵入性产前诊断 微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫 蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 1 对象与方法微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 1 1 研究对象从 2005 年 5 月至 2005 年 8 月在东南大学附 属中大医院妇产科进行产前检查的初孕孕妇中 随机选择 138 例 4 12 孕周 临床无感染征象 无其他产科合并症及并发症的 孕妇作为研究对象 微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 1 2 研究方法微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 1 2 1 仪器与试剂低温高速离心机 PCR 仪 eppendorf 公司 电子分析天平 上海精科天平仪器公司 凝胶成像系统 Syngene Gene Genius PixSys5500 点样仪 Cartesian Tech Inc ScanArray 5000 扫描仪 Packard BioScience 公 司 引物和探针由上海 Boya 公司合成 微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫 蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 1 2 2 微乳液多重 PCR 基因芯片法诊断胎儿性别微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江 苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 1 2 2 1 标本的处理及 DNA 的提取 所有研究对象抽取 3ml 外 周血 EDTA 抗凝 QIAampDNA 试剂盒提取血浆 DNA 的过程按说 明书进行 得到的 DNA 样品存放于 20 备用 微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 1 2 2 2 微乳液多重 PCR 扩增 选取 Y 染色体上的 6 个特异性 序列 SRY1 SRY2 SRY3 DYS1 DYS14 和 DYZ3 基因作为男性胎 儿标志物 同时以 globin 基因作为阳性内对照 在微 乳液中进行扩增 扩增条件为 95 预变性 3min 94 30s 50 30s 72 30s 40 个循环 72 延伸 8min 后冷却至 10 将扩 增产物用于 DNA 杂交 微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 1 2 2 3 DNA 芯片制备及 DNA 杂交 2ml1 5 的琼脂糖溶液均匀 平铺在洁净载玻片表面 凝固后 37 烘干 浸泡于 0 1molL 1 NaIO4 溶液中 30min 蒸馏水洗片 3 次 每次 5min 晾干后点样 7 对探针 DNA 序列见表 1 在 37 湿度为 90 条件下水化 1 5h DNA 芯片制备好后避光保存 在离心管中 加入扩增产物和杂交缓冲液 HB 各 15l 混匀后 95 水浴 变性 6min DNA 芯片于 20 预冷 6min 将变性好的杂交液滴 于芯片上的点样区 18mm18mm 盖玻片盖于其上 避光 置于 37 一定湿度下杂交 2h 分别用 2SSC 0 2 SDS 液 0 1 SSC 0 2 SDS 液 0 1 SSC 液洗涤 10min 室温晾 干后扫描 微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 1 2 2 4 芯片扫描及结果分析 用 ScanArray 5000 扫描仪扫描 芯片 532nm 波长的激光激发 Cy3 荧光 得到 Cy3 图像文件 通 过圈点确定杂交范围 过滤背景噪声 提取基因表达的荧光信号 强度值 用预先定的内参照基因 globin 基因 对 Cy3 的原始提取信号进行均衡和修正 用 stroppro 2 0 软件分析 Cy3 荧光信号的强度和比值 用以下 3 个条件作为判定基因阳 性表达的标准 1 Cy3 阳性点的荧光信号平均值超过阴性点信 号的 3 倍 ratio 比值范围在 2 7 3 3 2 阴性荧光信表 1 引 物及探针序列基 号值600 Cy3 阳性荧光信号值减去阴性 荧光信号值后400 3 PCR 结果良好 当阳性内对照基因 和各 Y 染色体基因均呈阳性时判定该样本为男性胎儿 阳性内 对照基因呈阳性而其余 Y 染色体基因及阴性对照基因均阴性时 判定该样本为女性胎儿 微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 1 3 统计学处理计算微乳液多重 PCR 基因芯片法在胎儿性 别诊断中的灵敏度与特异度以及约登指数 评价微乳液多重 PCR 基因芯片法对于早期胎儿性别的检测效力 微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 2 结 果微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 2 1 微乳液 PCR 检测效率以男性 DNA 为标准模板 梯度稀 释后以 DYS12 为引物进行微乳液 PCR 扩增 电泳结果显示微乳 液 PCR 的检出极限是 1 10 8 见图 1 M 为分子质量标准 从 上到下条带的分子质量分别为 1500 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 和 100bp微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 图 1 微乳液 PCR 扩增的电泳结果微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧 豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 2 2 基因芯片扫描结果胎儿 DNA 芯片检测典型扫描结果见图 2 每个样本重复检测 3 次 2 3 微乳液多重 PCR 基因芯片法检 测效力分析在 78 份男性胎儿孕育者血样中有 76 份血样所有 Y 染色体特异序列及阳性对照基因均呈阳性 其中最早的检出样 品来自怀孕 31d 的孕妇 60 份女性胎儿孕育者血样中没有一个 Y 染色体特异序列检测结果为阳性 微乳液多重 PCR 基因芯片 法对于男性胎儿的检测灵敏度为 97 4 特异度为 100 约登 指数为 0 97 见表 2 a 为 globin 阳性对照基因 b c d e f g 分别为 SRY1 SRY2 SRY3 DYS1 DYS14 和 DYZ3 基因 A 为芯片扫描阳性结果 即阳性内对照基因和各 Y 染色体基因均呈阳性时判定该样本为男性胎儿 B 为芯片扫描 阴性结果 即阳性内对照基因呈阳性而其余 Y 染色体基因均阴 性时判定该样本为女性胎儿 C 为未检测出所有 Y 染色体基因 的男性胎儿孕育者血样的芯片扫描结果 即假阴性结果表 2 微 乳液多重 PCR 的基因芯片法对胎儿性别的检测效力评价微乳液 多重 PCR 灵敏度 76 78100 97 4 特异度 60 60100 100 约登指数 97 4 100 1 0 9743 讨 论在早孕期诊断胎儿性别有利于了解胎儿患性连锁疾病的风险 目前早孕期诊断胎儿性别主要是依靠侵入性产前诊断 例如绒 毛膜活检 CVS CVS 通常在孕 12 周内进行 CVS 造成流产的危 险为 0 5 1 如果能在早孕期预先对胎儿性别进行无创性产 前诊断 就能使 50 的高危孕妇避免没有必要的侵入性产前诊 断 1997 年 Lo 等 2 发现孕妇的血浆和血清中存在游离胎儿 DNA 这一发现为我们开辟了一条无创性诊断胎儿性别的道路 目前无创性诊断胎儿性别的方法有普通 PCR 巢式 PCR 实时荧 光定量 PCR 等 主要是以 Y 染色体作为检测男性胎儿的标志 在早孕期 普通 PCR 检测的敏感度和特异度都较低 巢式 PCR 与传统的普通 PCR 相比具有快速 灵敏和特异等优点 巢式 PCR 在孕 7 40 周检测男性胎儿 DNA 的灵敏度为 96 100 特 异度为 88 100 3 5 多重 PCR 是基础研究和临床诊断中 多基因扩增的常用手段 6 然而传统的多重 PCR 往往不能有效 地扩增出所有的 DNA 片段 这主要是因为多对引物延伸时相互 影响 产物分析时信号相互干扰等原因 使其实际诊断位点数受 限 为了克服这个问题 在本研究中我们建立了微乳液多重 PCR 微乳液是水相在油相中被分散成极小液滴的具有热稳定性 的体系 在本实验中我们设计在微乳液中进行多重 PCR 扩增 将微乳液作为多重 PCR 的反应中介 微乳液系统包含了分散在 油相里的上百万个小液滴 这些小液滴提供了大量的微型反应 器 每个反应器内都能完成一个特定的 PCR 反应 这样就避免 了引物间以及和模板 DNA 相互干扰的问题 因此 多重 PCR 可 以在微乳液体系中有效地扩增 提高了胎儿 DNA 检测的灵敏度 本研究电泳结果显示 男性 DNA 标准模板梯度稀释后微乳液 PCR 的检出极限是 1 10 8 基因芯片能够高通量地平行检测胎 儿 DNA 在提高检测的灵敏度 特异度上有不可忽略的作用 与一次只能检测一个位点的实时荧光定量 PCR 相比 用本实验 方法可以同时检测 7 个位点 由于可以在同一芯片上进行整体 平行的研究 无论在诊断速度 灵敏度还是获得总信息量上与以 往检测手段相比都有很大提高 在本实验中 最早检出的男性 胎儿 DNA 是在孕 31d 这比 Wataganara 等 7 用实时荧光定量 PCR 检测胎儿 DNA 的最早检出时间还早 1d 有学者报道用普通 PCR 进行胎儿 DNA 的性别鉴定 8 他们的方法一次只能检测一 个样品 而且在扩增完成后产物要进行电泳 很容易造成污染 我们将 PCR 扩增产物直接与固定在玻片上的探针杂交 由于表 面固定技术和杂交冲洗技术的发展 非特异性的吸附不会对实 验结果造成影响 探针的杂交检测是在一致的条件下进行的 实验结果准确可靠 用微阵列芯片的方法进行性别相关的鉴定 阳性和阴性差异明显 结果清晰可见 不容易出现假阳性的试 验结果 我们采用微乳液 PCR 基因芯片法对 138 例 4 12 孕周初 孕孕妇的外周血液样品进行分析 检测男性胎儿 DNA 的灵敏度 为 97 4 特异度为 100 检测结果具有较高的可信性 综上 所述 这种基于微乳液多重 PCR 和基因芯片检测孕妇外周血中 男性胎儿 DNA 的方法具有较高的灵敏度和特异度 能够早期鉴 定胎儿性别 对性连锁遗传病的筛选具有潜在的应用价值 微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊 断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 参考文献 微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 1 Alfirevic Z Sundberg K Brigham S Amniocentesis and chorionic villus sampling for prenatal diagnosis J Cochrane Database Syst Rev 2003 3 CD003252 微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 2 Lo Y M D Corbetta N Chamberlain P F et al Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum J Lancet 1997 350 485 487 微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞 策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 3 Smid M Lagona F de Benassuti L et al Evaluation of different approaches for fetal DNA analysis from maternal plasma and nucleated blood cells J Clin Chem 1999 45 9 1570 1572 微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋 毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 4 Zhong X Y Holzgreve W Hahn S Detection of fetal rhesus D and sex using fetal DNA from maternal plasma by multiplex polymerase chain reaction J BJOG 2000 107 766 769 微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 5 Al Yatama M K Mustafa A S Ali S et al Detection of Y chromosome specific DNA in the plasma and urine of pregnant women using nested polymmerase chain reaction based diagnostic method for bacterial vaginosis J Obstet Gynecol 2002 100 4 759 764 微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液 多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 7 Wataganara T Chen A Y LeShane E S et al Cell free fetal DNA levels in maternal plasma after elective first trimester termination of pregnancy J Fertil Steril 2004 81 3 638 644 微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创性胎儿性别诊断中的应用微乳液多重 PCR 基因芯片法在早孕期无创 性胎儿性别诊断中的应用作者 晏菱 葛芹玉单位 东南大学临床医学院 东南大学附属中大医院 江苏 南京 210009 关键词 早孕期 Non invasive determination of fetal gender using microarray coupled with microe 稳粪睫蝶惕猾碗官狱漫潞策淮惮库易葫斜津骡粉挠掺脏蛹唇施孪疽楷模洽凿鸯抓海年酗斡桥惶龚窃员镁秧吕栋毕攘鲍隧豹萧卉晚闸靴闲撩羞洁顾票 8 Honda