南京农业大学生物化学课件14

第五节酶的提取纯化与活力测定 一 酶的分离与提取 酶提取基本的方法 细胞产生的酶有二类 1 由细胞内产生后分泌到胞外发挥作用的酶 称为细胞外酶 这类酶大部分属于水解酶 此类酶通常含量高 容易得到 2 在细胞内合成后并不分泌到细胞外 而在细胞内起催化作用 称为细胞内酶 该类酶在细胞内往往与细胞器结合 不仅有一定的区域性 而且催化的反应具有一定顺序性 A 了解所分离酶在细胞中分布 B 材料的获取 在提取某一酶时 首先应当根据需要 选择含此酶最丰富的材料 由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料限制 成本又很大 因此 目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂 一 酶的分离与提取 酶提取基本的方法 C 酶分离纯化的主要步骤 1 主要步骤为 抽提 纯化 结晶抽提 破碎细胞 动植物组织一般可用组织捣碎器 或者加石英砂研磨 将材料做成丙酮粉或进行冰冻融解 对细菌 常采用加砂或加氧化铝研磨和超声波振荡方法破碎 大多数酶一般都用缓冲液进行抽提 缓冲液的类型决定于酶的种类和理化特性 抽提液pH最好远离等电点 一 酶的分离与提取 酶提取基本的方法 C 酶分离纯化的主要步骤 1 主要步骤 抽提 纯化 结晶浓缩 抽提液或发酵液中酶浓度往往很低 必须浓缩富集 常用的浓缩方法有 加中性盐或冷乙醇沉淀后再溶解 胶过滤浓缩以及超过滤浓缩法等 纯化 纯化过程就是去除杂质的过程 原则 一方面是要提高酶的纯度 另一方面却也使酶的总量不可避免有所损失 一 酶的分离与提取 酶提取基本的方法 C 酶分离纯化的主要步骤 1 主要步骤为 抽提 纯化 结晶结晶 浓缩液经过各种方法的纯化 可得到较纯的结晶产品 一 酶的分离与提取 酶提取基本的方法 C 酶分离纯化的主要步骤 2 选择分离纯化方法a 盐析法 如硫酸胺 b 有机溶剂沉淀法c 层析纯化法 葡聚糖凝胶 阴离子交换层析 d 等电点法e 吸附分离法 一 酶的分离与提取 酶提取基本的方法 1 酶活力概念 酶活力是酶促反应的能力 酶活力大小就是指在一定条件所催化的某一化学反应速度的快慢 即酶催化的反应速度越快 酶活力越高 反之则表示该酶活力低 二 酶活力及其测定 但是 酶的定量并非对其蛋白质进行定量 而是对它的催化能力进行定量 所以 酶的定量就是测定酶的活力 也即测定酶促反应的速度 二 酶活力及其测定 1 酶活力概念 如何测定酶活力 以产物浓度对反应时间作图 可得到酶促反应速度曲线 注意 初速度的测定是关键 为什么 二 酶活力及其测定 1 酶活力概念 可见 反应速度只在最初一段时间内保持恒定 随着时间的延长 反应速度逐渐下降 原因底物浓度的降低 产物的增加造成的逆反应的加快产物的抑制作用酶本身逐渐失活 二 酶活力及其测定 1 酶活力概念 常用的酶活力单位有三种 A 国际单位 IU 这种单位是由国际酶学委员会规定的 在标准条件 25 最适pH 最适底物浓度 下 酶每分钟催化1mmol底物转化 这样的速度所代表的酶的活力即酶的量定义为1个国际单位 IU 2 酶活力与单位 二 酶活力及其测定 B Katal 是由国际酶学委员会于1972年规定的一种新单位 在最适条件下 酶每秒钟催化1mol底物转化 这样的速度所代表的酶的活力即酶的量定义为1个Kat 1Kat 60 106IU 2 酶活力与单位 2 酶活力与单位 二 酶活力及其测定 C 自定义的活力单位 这种单位简单方便 省去了许多计算 但只能进行酶活力的相对比较 酶习惯上或测定时使用的反应速度的单位定义为酶的活力单位 有的甚至直接用测得的物理量 如单位时间内消光值的变化 DA t 表示酶活力单位 2 酶活力与单位 2 酶活力与单位 二 酶活力及其测定 指每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数 比活力是酶制剂纯度的常用指标 比活力越大 表示酶越纯 3 酶的比活力 二 酶活力及其测定 纯化倍数 每次比活力 第一次比活力 产率 回收率 每次总活力 第一次总活力 100 4 酶的纯度 二 酶活力及其测定 1 某酶在一定条件下 5min内使30mmol底物转变为产物 问该酶的活力 IU 是多少 2 从某细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液300mL含有150mg蛋白质 总活力为360单位 经过一系列纯化以后得到的4mL酶制品 含有