分子发光分析

1 第五章分子发光分析法 2 3 4 第五章分子发光分析法 分子荧光 磷光分析法的基本原理荧光分析仪器分子荧光定量分析简介化学发光 5 5 1概述 一 分子发光分析法及其分类某些物质的分子吸收一定能量后 电子从基态跃迁到激发态 以光辐射的形式从激发态回到基态 这种现象称为分子发光 在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法 较高激发态 基态 吸收能量受激 光辐射退激 6 根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类 光致发光 以光源来激发而发光生物发光 以生物体释放的能量激发而发光化学发光 以化学反应能激发而发光 化学发光分析法 荧光 荧光分析法磷光 磷光分析法 7 二 分子荧光分析法的特点 1 灵敏度高荧光强度随激发光强度增强而增强 提高激发光强度 可提高荧光强度 采用高灵敏度的检测系统可大大提高灵敏度 检测限荧光分析法比分光光度法低2 4个数量级 8 2 选择性好不同的物质用不同的光进行激发 选择不同的激发光波长不同的物质发射的荧光不同 选择不同的检测荧光波长比较容易排除其它物质的干扰 选择性好3 实验方法简单4 待测样品用量少 仪器价格适中 测定范围较广 根据发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物 广泛应用在生物化学 分子生物学 免疫学及农牧产品分析 卫生检疫等领域 荧光法比磷光法应用广泛 不如分光光度法 9 5 2荧光和磷光光谱法 一 荧光和磷光光谱的产生具有不饱和基团的基态分子光照后 价电子跃迁产生荧光和磷光基态分子价电子跃迁到激发态 光照激发 去激发光 n 基态 在光致激发和去激发光的过程中 分子中的价电子 n电子 处于不同的自旋状态 通常用电子自旋状态的多重性来描述 10 1 电子自旋状态的多重性 大多数分子含有偶数电子 基态分子每一个轨道中两个电子自旋方向总是相反的 处于基态单重态 2S 1 1 用 S0 表示 当物质受光照射时 基态分子吸收光能产生电子能级跃迁 由基态跃迁至更高的单重态 电子自旋方向没有改变 净自旋 0 这种跃迁是符合光谱选律的 S0 S1 S2 S3分别代表基态 第一 二 三激发单重态 单重态分子具有抗磁性 激发态的平均寿命约为10 8 11 若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变 由基态单重态 激发三重态 净自旋 0 这种跃迁为禁阻跃迁T1 T2 T3分别表示第一 二 三激发三重态 自旋平行 三重态分子具有顺磁性 激发态的平均寿命约为10 4 10S 12 传递途径 辐射跃迁 无辐射跃迁 荧光 延迟荧光 磷光 振动弛豫 内部转移 系间窜跃 外部转移 分子中电子受激跃迁到激发态后 处于激发态的分子是不稳定的 去激返回到较低激发态或基态时有两种方式 无辐射去激和辐射去激 13 2 无辐射去激 不伴随发光现象的过程叫无辐射去激 体系内的多余的能量以热的形式释放 包括 振动驰豫内部转换系间窜跃外部转移 14 T1 S0 吸光吸光 S0 S1 S2 15 发生系间窜跃电子需转向 S1 T1间进行 比内部转换困难 外部转移 指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转移 使荧光或磷光强度减弱或消灭 16 3 荧光和磷光光谱的产生 辐射去激 处于S1或T1态的电子返回S0态时 伴随有发光现象 这种过程叫辐射去激S1或T1S0 发光 1 荧光 当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基态S0各振动能级所产生的光辐射叫荧光 VR VR IC 吸光吸光荧光 S0 S1 S2 17 T1 S0 VR VR IC 吸光吸光荧光图7 1分子荧光光谱产生过程示意图 S0 S1 S2 VR 振动驰豫IC 内部转换ISC 系间窜跃 18 荧光是相同多重态间的允许跃迁 产生速度快 10 9 10 6s 又叫快速荧光或瞬时荧光 外部光源停止照射 荧光马上熄灭 无论开始电子被激发至什么高能级 它都经过无辐射去激消耗能量后到S1的最低振动能级 发射荧光 荧光波长比激发光波长长 荧 激 19 2 磷光 当受激电子降到S1的最低振动能级后 未发射荧光 而是经过系间窜跃到T1振动能级 经振动驰豫到T1最低振动能级 从T1最低振动能级回到基态的各个振动能级所发射的光叫磷光 20 T1 S0 ISC VR VR IC 吸光吸光荧光磷光图5 1分子荧光 磷光光谱产生过程示意图 S0 S1 S2 VR 振动驰豫IC 内部转换ISC 系间窜跃 VR 21 从T1 S1要改变电子自旋 发光速度慢 约为10 4 10s 光照停止后 磷光仍可持续一段时间分子相互碰撞的无辐射能量损耗大 所以磷光的波长更长 磷 荧 激 易产生荧光n 易产生磷光 22 二 荧光 磷光与分子结构的关系 了解荧光与分子结构的关系 可以预测哪些物质能产生荧光 在什么条件下产生 以及发射的荧光有什么特征以便更好地运用荧光分析技术 采取一些措施把不发荧光的物质产生荧光 即把非荧光体变成荧光体 弱荧光体变成强荧光体 一 荧光效率 荧光量子效率 量子产率荧光强度常用荧光量子效率 f来描述荧光量子效率 f f是一个物质荧光特性的重要参数 反映了荧光物质发射荧光的能力 f越大 荧光越强 在0 1之间 23 若以各种跃迁速率常数来表示Kf为荧光发射过程的速率常数 取决于物质的化学结构 Ki为非辐射跃迁的速率常数之和 主要取决于化学环境 也与化学结构有关 分析上有应用价值的荧光化合物的荧光效率在0 1 1之间 24 至今对激发态分子的性质了解不深 无法定量地描述荧光与分子结构之间的关系一般情况 有机芳香族化合物及金属离子配合物是最强最有用的荧光体 二 荧光磷光与有机化合物结构的关系1 跃迁类型大多数荧光物质首先吸收紫外可见光 产生 n 跃迁激发 经过非辐射跃迁 再发生 n跃迁产生荧光 与n 跃迁相比 摩尔吸收系数大102 103倍 寿命短 跃迁常产生较强的荧光 n 跃迁产生的荧光弱 但可产生系间窜跃 产生更强的磷光 25 2 共轭效应 有较强的荧光具有共轭体系的芳环或杂环化合物 电子共轭程度越大 越易产生荧光 环越多 共轭程度越大 产生荧光波长越长 发射的荧光强度越强 f ex nm em nm 26 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系 多数能发生荧光 多环芳烃是重要的环境污染物 可用荧光法测定例 3 4 苯并芘 是强致癌物 ex 386nm em 430nm 27 3 刚性平面结构 较稳定的平面结构 具有强荧光的分子多数有刚性平面结构 荧光素 氧桥把两个环固定在一个平面上 具有平面结构 强荧光物质 酚酞 无氧桥把两个环固定 不能很好的共平面 为非荧光物质 28 例1 2 二苯乙烯 反式 平面构型强荧光体 顺式 非平面构型非荧光体 29 4 取代基效应 取代基对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影响 分成三类 1 增强荧光的取代基 有 OH OR NH2 NHR NR2等给电子基团 由于基团的n电子 孤对电子 的电子云与苯环上的 轨道平行 共享了共轭 电子 扩大了共轭体系 使荧光波长长移 荧光强度增强 30 2 减弱荧光的取代基 COOH NO2 COOR NO SH吸电子基团 使荧光波长短移 荧光强度减弱芳环上被F Cl Br I取代后 使系间窜跃加强 磷光增强 荧光减弱 其荧光强度随卤素原子量增加而减弱 磷光相应增强 这种效应为重原子效应 3 影响不明显的取代基 NH3 R SO3H等取代基的空间位阻对荧光也有影响 荧光减弱 31 5 电子跃迁类型 含N O S杂原子的不饱和有机物 如喹啉和芳酮类物质都含有未键合的孤对n电子 电子跃迁多为n 系间窜跃强烈 荧光很弱或不发荧光 不含N O S杂原子的有机荧光体多发生 类型的跃迁 摩尔吸收系数大 约为104 荧光强 32 三 金属螯合物的荧光 大多数无机盐类金属离子 不能产生荧光 但某些螯合物都能产生很强的荧光 可用于痕量金属离子的测定 不少有机配体是弱荧光体或不发荧光 但与Mn 形成螯合物后变为平面构型 就会使荧光加强或产生荧光 例 8 羟基喹啉为弱荧光体 与Mn Al3 Mg2 形成螯合物后 能形成刚性结构 荧光加强 33 三 环境对荧光 磷光的影响 1 溶剂的影响同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质一般来说 溶剂的极性增强 荧光波长长移 荧光强度增大 2 温度的影响 低温下测定 提高灵敏度大多数荧光物质都随溶液温度升高荧光效率下降 荧光强度减弱 温度对磷光影响更大 34 3 pH的影响 大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光性质受溶液pH的影响很大共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体 具有各自的荧光效率和荧光波长 6 pH 1有荧光 pH 13无荧光 无荧光 有荧光 另外 表面活性剂也会影响荧光强度和特性 35 四 荧光强度与荧光物质浓度的关系 用强度为I0的入射光 照射到液池内的荧光物质时 产生荧光 荧光强度If用仪器测得 在荧光浓度很稀时 荧光物质发射的荧光强度If与浓度有下面的关系 Ia为吸收的辐射强度I0为入射光强度 If f I0 I010 A fI0 1 10 A I I010 A 将上式展开 If fIa f I0 I 36 当A 0 05时 方括号中其它各项与第一项相比可忽略不计 上式简化If 2 3 fI0A 2 3 fI0 cL 当A 0 05时 If与 f I0 和c有关 对一给定物质 当激发光波长和强度一定时 f I0 和L为常数 合并为KIf KcIp Kc 定量分析依据 37 荧光强度与物质浓度呈线性关系 If Kc只有在浓度低时使用 荧光物质测定的是微量或痕量组分 灵敏度高 浓度高时 If与c不呈线性关系 有时c增大 If反而降低 因为公式 中后面影响 有时发生荧光猝灭效应 If Kc 38 荧光猝灭 荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化学反应 或发生碰撞后使荧光强度下降或荧光效率 f下降称为荧光猝灭 使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂Q氧分子及产生重原子效应的溴化物 碘化物等都是常见的荧光猝灭剂 碰撞猝灭 M 激 M M Q MQ 热自熄灭 荧光物质发射的荧光被荧光物质的基态分子所吸收 即自吸收现象 39 一 荧光分析仪器 主要由光源 单色器 液槽 检测器和显示器组成 与分光光度计有两点不同 两个单色器 检测器与激发光互成直角 五 荧光和磷光分析仪器 40 荧光分光光度计示意图 光源 第一单色器 样品池 第二单色器 光电倍增管 显示器 41 1 光源 激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度 适用波长范围宽荧光计中 常使用卤钨灯作光源荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯 利用汞蒸气放电发光的光源 常用其发射365nm 405nm 436nm三条谱线以365nm的谱线最强 应用最广泛的一种光源 可发射250 800nm很强的连续光源 42 2 单色器 荧光计用滤光片作单色器 荧光计只能用于定量分析 不能获得光谱 大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器 有较高的分辨率 能扫描图谱 既可获得激发光谱 又可获得荧光光谱 第一单色器作用 分离出所需要的激发光 选择最佳激发波长 ex 用此激发光 ex激发液池内的荧光物质 VB2 ex为471nm 第二单色器作用 滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光 用来选择测定用的荧光波长 em 在选定的 em下测定荧光强度 定量分析 VB2 em为525nm 43 3 样品池 盛放测定溶液 通常是石英材料的方形池 四面都透光 只能用手拿棱或最上边4 检测器把光信号转化成电信号 放大 直接转成荧光强度荧光的强度一般较弱 要求检测器有较高的灵敏度 荧光光度计采用光电倍增管 5 读出装置记录仪记录或打印机打印出结果 扫描激发光谱和发射光谱 荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度 是因为荧光强度与激发光强度成正比 提高激发光强度可大大提高荧光强度 44 二 激发光谱和荧光 磷光光谱 激发光谱 荧光和磷光均为光致发光 合适的激发光波长需根据激发光谱确定 激发光谱是在固定荧光波长下 测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱 激发光谱固定 em荧光波长 获得方法 先把第二单色器的波长固定 使测定的 em不变 改变第一单色器波长 从200 700nm扫描 让不同波长的光照在荧光物质上 测定它的荧光强度 以I为纵坐标 ex为横坐标得左图 即荧光物质的激发光谱 从曲线上找出 ex 实际上选波长较长的高波长峰 45 荧光光谱固定 ex激发光波长 获得方法 先把第一单色器的波长固定 使激发的 ex不变 改变第二单色器波长 让不同波长的光扫描 测定它的发光强度 以I为纵坐标 em为横坐标得左图 即荧光物质的发射光谱从曲线上找出最大的 em 46 激发光谱和荧光光谱 荧光强度 波长 nm 300 400 500 硫酸奎宁的两个光谱 I ex max fl max 47 磷 荧 激 吸收峰 荧光峰 磷光峰 吸收光谱 荧光光谱和磷光光谱 48 三 磷光分析仪器 与荧光分析仪器相似 主要差异如下 1 试样室测定低温磷光时试样需在液氮温度 77K 196 下进行 将液池放在盛放液氮的杜瓦瓶内 固体表面室温磷光分析需特制试样室 2 磷光镜有些物质既可产生荧光 又能产生磷光 用机械切光装置 磷光镜区别荧光和磷光 利用荧光寿命短 磷光寿命长消除荧光干扰 49 六 荧光 磷光分析及应用 一 定量分析方法定量分析依据If KcIp Kc1 标准曲线法 最常用的定量分析方法将已知量的标准物质与试样在相同条件下处理 配制一系列标准液 测定它们的相对发光强度 以相对荧光强度为纵坐标 以标准溶液的浓度为横坐标浓度c1c2c3c4c5cx荧光强度If1If2If3If4If5Ifx 50 2 比较法 较简单 如果试样数量不多 可用比较法进行测量配一标准溶液浓度为cs cs与未知液浓度cx相近 并在相同条件下测定它们的荧光强度未知液Ifx Kcx标准液Ifs Kcs 比较 51 3 多组分混合物的荧光分析 1 如果两组分的荧光峰相互不干扰 可直接测定可分别在各自的 荧波长处测定 求出它们的含量 2 如果两组分的荧光峰相互干扰 但激发光谱有显著区别 在某一激发光下一个组分产生荧光峰 另一组分不产生荧光 可选用不同的激发光进行测定 52 3 如果两组分的荧光光谱和激发光谱相互干扰 利用荧光强度的加和性 If If1 If2 If3 在适宜的荧光波长处测定 用联立方程来求解例 硫胺荧CT ex 385nm em 435nm吡啶硫胺荧CP ex 410nm em 480nm 相互干扰荧光光谱重叠 在385nm下激发 在435和480nm下分别测荧光强度 或410nm下激发在435和480nm下分别测荧光强度 53 在385nm下激发 在435和480nm下分别测荧光强度 If Kc K 纯物质在选定波长下测If 求K 或410nm激发 在435和480nm下分别测荧光强度 54 二 荧光分析法的应用 荧光分析法具有灵敏度高 取样量少等优点1 无机化合物的分析无机化合物中 能直接产生荧光并应用于测定的为数不多 但与有机化合物生成发荧光的有机配合物后 进行荧光分析的元素达70多种 其中较常采用荧光法测定的元素有 Be Al B Ga Se Mg Zn Cd及某些稀土元素 能够同金属离子形成荧光配合物的有机试剂绝大多数是芳香族化合物 形成五元环或六元环的螯合物 分子的刚性平面结构增大 变为强荧光体 荧光猝灭法也是荧光分析中经常采用的方法 可采用荧光猝灭法间接测定的离子有 F S2 Fe3 Co2 Ni2 Cu2 等 55 2 有机化合物的分析 脂肪族有机化合物的分子结构较为简单 本身能发荧光的很少 一般需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系 多数能发荧光 可直接用荧光法测定 对于具有致癌活性的多环芳烃 荧光分析法是最主要的测定方法 为提高测定的灵敏度 有时也将芳香族化合物与适当试剂反应之后进行测定 56 可测定结构复杂的大量有机物质 如 各种维生素 叶绿素 氨基酸 蛋白质 酶和辅酶以及各种药物 毒物和农药等 57 例 VB2 又称核黄素 是一种生长促进剂 常存在于动物肝脏 肉类 蛋黄 豆类 花生 蘑菇和海藻中 VB2易溶于强酸或强碱性溶液 在低浓度情况下 I Kc I与c呈线性关系 在 ex光照射下 发出绿色荧光 em 525nm下测I 用标准曲线法测定 缺VB2会得口角炎 舌炎 唇炎 脂溢性皮炎 维生素B2 58 例 3 4 苯并芘的测定 3 4 苯并芘为强致癌物质 煤炭 石油 天然气等燃料不完全燃烧以及吸烟 焚烧垃圾都会产生3 4 苯并芘 汽车尾气也是主要来源 食品加工过程也会产生3 4 苯并芘 尤其是烟熏 油炸 烘烤食品 分析测定 用环己烷将3 4 苯并芘从试样中提取出来 用碱将提取液的脂肪类物质皂化 然后用色谱法分离纯化 用95 C2H5OH稀释 用荧光分光光度计测定相对荧光强度进行定量 59 三 磷光分析法应用 能产生磷光的物质数量很少 磷光分析不及荧光分析普遍 但磷光分析法已在药物分析 临床及环境分析领域得到一定的应用 低温磷光分析已应用在萘 蒽 菲 芘 苯并芘等多环芳烃及含O S N的杂环化合物分析 固体表面室温磷光分析法已成为多环芳烃和杂环化合物的快速 灵敏的分析手段 60 5 3化学发光分析法 一 概述化学发光是利用化学反应所产生的光辐射现象所建立的分析方法 化学发光与荧光的主要区别 受激发时所需的能量来源不同化学发光 需要化学反应过程中所提供的化学能激发而发光荧光 光源激发而发光 61 化学发光分析具有以下特点 灵敏度高 例 用荧光素酶和三磷酸腺苷ATP的化学发光反应 可测定低至2 10 17mol L 1ATP线性范围宽 一般有5 6个数量级仪器设备简单 成本低廉分析速度快 易实现自动化局限性 可供发光用的试剂有限发光机理有待进一步研究 62 二 化学发光分析的基本原理 一 化学发光反应的基本条件发光反应必须满足以下条件1 化学反应必须产生足够的化学能化学发光基于化学反应提供足够的能量A B C D产物接受反应能被激发在可见光区观察化学发光 需170 300kJ mol 1激发能 具有过氧化物中间产物的氧化还原反应可满足要求 化学反应多是在有O3 H2O2等参加的高能反应中 2 处于激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态C C h 63 二 化学发光效率和发光强度 化学发光效率 CL 激发态分子的化学效率 激发态分子的发光效率 r取决于发光所依据的化学反应本身 f与荧光效率的影响因素相同 既取决于发光体本身的结构和性质 也受环境的影响 64 化学发光强度 具有高效率的化学发光是生物体中 亦称生物发光 如 萤火虫发光反应的效率几乎接近100 非生物体的化学发光效率一般不超过1 化学发光强度ICL t 与反应速度 化学发光效率有如下关系 ICL随时间和反应物的消耗逐渐减小 65 A B C DA为待测物质 C为发光物质 当反应物B的浓度远远过量于待测物浓度时 B的浓度可认为是常数 因此 发光反应可视为一级反应 t时刻的发光强度与该时刻的分析物浓度成正比化学发光总强度与分析物浓度呈线性关系 根据已知时间内的发光总强度来定量分析 发光总强度 66 三 化学发光反应的类型 1 液相化学发光 研究和应用的比较广泛的有鲁米诺 Luminol 光泽精 没食子酸 洛粉碱 过氧草酸盐等 鲁米诺是最常用的发光试剂 它可以测定Cl2 I2 HOCl OCl H2O2 O2和NO2 产生化学发光反应时量子效率为0 01 0 05 鲁米诺 3 氨基苯二甲酰环肼 在碱性溶液中和H2O2等氧化剂反应生成最大波长为425nm的光辐射