海洋微生物抗生素的开发方案

海洋微生物抗生素的开发方案摘要：海洋微生物种类约为陆生微生物的20倍以上。海洋微生物由于其高盐、高压、低温、低光照和寡营养的特殊的生存环境，从而可合成一些结构新颖的陆生微生物所不具备的抗生素。高质量的海洋微生物菌种库及其天然产物库是新药开发的重要来源。开发海洋微生物资源并从中筛选出有效的新抗生素具有重要的意义。【1】本文中将介绍筛选抗生素的国内外研究进展，并详细介绍海洋微生物进行菌株鉴定、抗生素的筛选分离提取，活性成分化学显色的初步研究的实验方法及所涉及的相关技术。关键词：海洋微生物，抗生素，筛选，提取分离纯化，结构鉴定1.立题背景1.1 海洋微生物抗生素研发意义: 海洋微生物抗生素的研究源于二十世纪上半叶对陆生微生物资源开发的巨大成就。自从1929年发现青霉素以来，迄今已有超过120种的陆生微生物的次生代谢产物用作临床上的抗生素药物。抗生素(Antibiotics)最初是指由微生物产生，具有相对选择毒性，在极低浓度下能抑制病原微生物(或癌细胞)生长繁殖的物质。众所周知，半个世纪以来，陆栖微生物早已成为抗生素、酶抑制剂等生物活性物质的重要资源，一度形成了辉煌的抗生素时代。随着抗生素的广泛应用，在临床上引起两个问题：一是细菌耐药性逐年增加，致使一些抗生素的疗效降低，甚至无效；另一问题是一些不致病的细菌成为条件致病菌，在临床上造成一定的威胁。因而需要不断筛选新结构和新的抗菌作用机制的新抗生素以满足临床需要。然而对陆生微生物的长期研究已使得陆地这一古老资源日趋枯竭，因此，拓宽寻找新药的途径迫在眉睫。据研究发现，约27的海洋微生物都能产生抗菌活性物质。已经成为筛选新型抗生素的重要来源。【2】1.2 背景:从海洋微生物研究抗生素的历史可以追溯到19世纪末。1889年，De Giaxa发现海水对炭疽杆菌和霍乱弧菌的生长具有抑制作用，指出海洋微生物可能产生抑制细菌生长的物质”1966年Burkholder等从波多黎各海域分离到的食溴假单胞菌产生的含溴吡咯类抗生素硝吡咯菌素(Pyrolnitrin)”，标志着从海洋微生物分离抗生素物质的开始。【3】1.3 现状:20世纪70年代中期，海洋微生物抗生素研究进入了加速发展期。东京大学微生物研究所率先开展了卓有成效的系统研究，在此后十几年间该研究所对海洋细菌，特别是海洋沉集物中的放线菌进行了深入的研究，奠定了海洋微生物抗生素研究的基础。美国加利佛尼亚大学Scripps海洋研究所Fenical教授领导的科研小组，对海洋微生物同样进行着长期不懈的研究。从1988年开始，该小组先从虾卵表面以及一种丝状蓝藻表面的共生细菌入手，这些共生细菌明显具有分泌拮抗物质抵御病原体入侵共生体的作用。1989年报道从1000 m的深海中分离到一株嗜盐的革兰阳性菌，产生一系列新的细胞毒性和抗真菌的大环内酯AF，作为主要的代谢产物，大环内酯A，还对单纯疱疹病毒和HIV病毒有抑制效果。目前Fenical研究小组共报道获得14种新的抗生素。美国的其它一些实验室，德国、法国、加拿大、西班牙等国的研究机构也都在开发新的海洋微生物抗生素，已发现了26种新抗生素。1.4 国内外研究进展:1.4.1 来源于海洋细菌和放线菌的抗生素。 Bell从硬磷鱼(Ostracion CUbicus)的毒液中分离纯化出副溶血弧菌，分离得到吲哚类衍生物Vibrindole A，对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌和枯草杆菌有一定的抑制活性。【4】Fenical研究组从链霉菌中得到4种稀有的吩嗪衍生物卜异鼠李糖酯类化合物，具有很强的广谱抗菌作用。【5】方金瑞等对海洋底栖菌进行活性筛选的过程中发现耐盐嗜碱放线菌2B，产生的抗菌物质2B-B经研究是氨基糖苷类的丁酰苷菌素。该研究开辟了氨基糖苷类抗生素化学结构修饰的新途径。【6】1.4.2 来源于海洋真菌的抗生素。Kobayashi研究组从琉球红藻门植物Ceratodictyon 体表分离到的真菌的发酵液中得到五环蕙环类衍生物Ser agaki none A。【7】Wi lkinson等从来自印度洋的曲霉菌的培养液分离到一种新型环缩二氨酸Gl i ot oxi n。Albaugh等报道从我国深圳潮间带红树上分离到一株海洋真菌Hypoxylon oceanicum LL-15G256。1.5 海洋抗菌活性物质研究的难点及解决的方法 开发海洋药物则有许多因难，其关键在于药源难以解决。事实上，绝大多数海洋生物活性物质含量极微。这一特征表明，对大部分活性物质来说，直接利用海洋生物作原料进行分离提取，是很难满足需求的。今后一段时期内有关海洋微生物的生物活性物质的研究重点将主要集中在以下几个方面：(1)扩大筛选范围，寻找新的具有药用价值的微生物资源，并建立适合海洋生物活性物质的大规模筛选技术。(2)继续深入开展对海洋微生物的分离提取和培养方法的研究。(3)结合现代发酵工程技术，研究适合于海洋微生物的发酵工艺条件和修饰方法，加快利用海洋微生物生产海洋药物及保健品的工业化进程。(4)结合现代生物工程技术，提高海洋生物产物的质和量，重视可再生资源的研究与开发，保证海洋生物资源持续有效的被利用。2.海洋微生物抗生素研究方案(提取精制流程） 本课题的基本思路是通过菌株筛选分离，抗生素活性筛选，通过高效液相色谱分析，薄层色谱分析及自显影技术来确定抗生素的分子组成。对已经构建的海洋微生物天然产物库进行质量评价，建立活性筛选模型，设计了引物，通过PCR 扩增的方法对海洋微生物库进行序列筛选。2.1 海洋微生物抗生素的分离及纯化2.1.1抗真菌活性的测定 采用琼脂块法。将分离到的海洋微生物涂布于海洋微生物分离培养基上，30 培养5d，用无菌打孔器打下一块，分别轻贴于表面涂布有指示菌的指示培养基平板上，30培养1-2d，观察并测量抑菌圈直径。也可以采用纸片扩散法测定, 细菌测定培养基为肉膏琼脂( pH7. 0) , 37 度培养过夜; 真菌测定培养基为沙氏琼脂( 自然pH ) , 28 度培养约24 48h 后测量抑菌圈直径。21.2 代谢产物的提取分离纯化 抗生素的分离纯化，目的在于从发酵液或培养液中分离纯化具有一定纯度的代谢产物。按常规的稀释涂平板法涂平板，30 培养3-5 d，挑单菌落接种于对应的培养基斜面，30培养3-5d。抗生素的一般分离纯化方法为：微生物发酵液的预处理，其目的不仅在于分离菌体和其他悬浮颗粒。还着眼于除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于提取和精制后续各工作的顺利进行。杂质主要包括：可溶性胶体物体，其中主要是杂蛋白、多糖和核酸，含有高价金属离子的无机盐。这些杂质不仅使发酵液粘度增大，降低液固分离速度，还会影响到后续的提取与纯化工作产品质量。因此应通过预处理的方法，尽可能的去除这些杂质。由微生物产生的产物，大都处于细胞内部，要分离和提取这些产物，则首先需要收集菌体，进行细胞破碎。破碎细胞的主要方法有：机械法有高压匀浆法、高速珠磨法及超声波法。非机械法有化学渗透法、酶解法、冻结一融化法、干燥法等。然后对发酵液进行固液分离，常用的方法有过滤和离心。2.1.3抗生素的主要的分离方法： 抗生素常用的分离纯化方法主要有溶媒萃取法、吸附法、离子交换法、沉淀和结晶、色谱分离等。在提取时，可根据抗生素分离的难易，单独或同时使用上述方法。 2.1.3.1溶媒萃取法是用一种溶剂将物质从另一种溶液中提取出来的方法，这两种溶剂不能互溶或只部分互溶，能形成便于分离的两相。 单级萃取只有一个混合器和一个分离器的萃取。多级错流萃取是由数个萃取器串联组成，料液经萃取后的萃余液依次流人下一萃取器用新鲜萃取剂继续萃取。多级逆流萃取由多个萃取器串联组成，其特点是料液与萃取剂分别由两端加入，溶剂与料液互成逆流接触。 2.1.3.2吸附法:附法是利用吸附剂与抗生素之间的分子引力而将抗生素吸附在吸附剂上。常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、大孔吸附树脂等.大孔吸附树脂适合于吸附各种抗生素，它不仅可吸附脂溶性化合物，而且可以吸附水溶性化合物.例如，姬生宝等藤黄灰链霉菌发酵液中的抗真菌活性成分SLl03采用X一5型吸附树脂对活性物质进行分离纯化，对吸附饱和的X一5树脂柱用去离子水冲洗，然后用50的甲醇洗去杂质和色素，再用50的乙醇4mLmin的流速下进行洗脱，合并活性高的洗脱液，浓缩后静置48h得到SLl03的粗结晶。通过对结晶进行分析，实验结果表明，此结晶纯度可达95以上；经过质谱分析，得知其为一种小分子量的抗生素，分子量为6625。2.1.3.3 离子交换法是利用某些生物药物能在溶液中形成带电粒子，与合成离子交换树脂之间结合力的差异来进行分离的方法。带电粒子与离子支换树脂间的作用力是静电力，它们的结合是可逆的。对强碱性产物宜选用弱酸性树脂。对弱碱性产物宜选用强酸性树脂；同理，弱酸产物宜用强碱性树脂，强酸性产物宜用弱碱性树脂。对树脂的选择还应要求对产物与主要杂质的吸附力有足够的差异。由于抗生素分子体积较大，一般选择大孔网状树脂。 2.1.3.4 沉淀法和结晶法：沉淀法广泛用于蛋白质等大分子的提取中。它主要起浓缩作用，纯化的效果较差，通常作为初步分离的一种方法。沉淀法分为5种类型：1)盐析：加入高浓度的盐使蛋白质沉淀，其机理为蛋白质分子的水化层被除去，而相巨吸引。2)加入有机溶剂：其机理为加入有机溶剂会使溶液的介电常数降低，从而使水分子的溶解能力降低，在蛋白质分子周围，不易形成水化层。缺点是有机溶剂常会引起蛋白质失活。3)调pH至等电点：此法沉淀能力不强，常加入有机溶剂，使沉淀完全。4)加入非离子型聚合物：如PEG等。结晶抗生素工业中常用的结晶方法有以下4种：蒸发结晶，化学反应结晶，过饱和冷却结晶和盐(溶)析结晶等。2.1.3.5色谱法色谱法是基于混合物各组分在两相(固定相和流动相)之间的不均匀分配进行分离的一种方法。其基本原理是由于混合物中的各个单一组分对两相不同的亲和力和向两相不均匀扩散的可能性而导致在同定相和移动相之间的不均匀分配，从而得到分离。按两相所处的状态分；液相色谱 以液体作为流动相，可分为液固色谱及液液色谱； 气相色谱，以气体作为流动相，可分为气固色谱及气液色谱。按操作形式分柱色谱，将固定相装在柱内，使混合物溶液沿一个方向移动而得以分离；纸色谱，用滤纸作为固定相载体，混合物溶液点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的；薄层色谱，在玻璃板上涂布固体粉末薄层为固定相，点样后用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。本实验中采用薄层色谱(Thin Layer Chromatography) 常用TLC表示，又称薄层层析，属于固一液吸附色谱。用硅胶G薄板(20cm15era0025cm)分离海洋细菌菌株产生的抗真菌物质，展开剂用甲苯：乙酸乙酯：90甲酸(VvV)=6：3：1可得到不同真菌活性物质，采用硅胶G薄板以正丁醇：乙酸：水(VVV)=3：1：1为展层剂进行操作，通过生物显影技术，确定分离的为单一组分的抗生素。也可采用高效液相色谱9HPLC)分离方法，参考孙强等人所做的实验，用反相色谱柱SinochromODSBPC1(8300mm46mm id，5“m)对放线菌菌株MY02发酵液中的抗真菌活性物质SN06进一步纯化，以甲醇一水系统(80：20，VV)为流动相，流动相流速为04mLrain，柱温30，紫外检测波长304nm。8044min和17347min两个吸收峰的收集液具有明显的活性，纯度较高。【5】在本实验中可依次采用上述方法中的大孔吸附树脂吸附法,薄层色谱法(TLC),正相硅胶柱层析法,反相柱层析法,高效液相色谱法等各种手段结合来完成。从而达到有效分离纯化抗生素的目的，得到所需的活性化合物2.2 抗菌活性物质组分的确定 所用的试验方法如下：TLC生物自显影（将样品溶解，点样于TLC板上，用展开剂展开。取灭过菌的培养皿加入融化的固体培养基10 mL，水平放置使之凝固作为底层。将上述TLC板正面朝上贴放其上，将20 mL刚灭菌的上层培养基冷至40左右，加入50l培养24 h的指示菌悬液，混匀，将含菌培养基小心浇注到TLC板表面，形成约3 mm厚的覆盖层。将培养皿置4C冰箱中倒置12 h，待TLC板上成分充分扩散到培养基中。培养皿置于37培养箱中培养24 h后，在培养基表面加噻唑蓝(MTT)溶液12 mL(MTT水溶液为橙黄色，浓度5 mgmL-1)，染色23 min，吸去多余染色液，于37培养1 h，观察及拍照。） 首先对菌株扩大培养,配制光合细菌液体培养基，然后通过大孔吸附树脂联用提取菌液中的活性物质，对固相萃取物进行TLC分析，并且制备薄层层析活性追踪，对活性条带进行TLC分析及生物自显影，最后对活性条带及H103树脂本底HPLC分析，同时采用紫外光谱，质谱，核磁共振谱，红外光谱等分析方法对组分结构进行分析即可确定该活性化合物的分子组成。2 研究发现培养基的不同对海洋微生物菌种多样性及活性菌株的发现几率有很大关系，提示我们要增加培养基的多样性来提高活性菌的发现几率。3. 总结 发酵液中分离纯化抗生素，是抗生素新药研发的难点。根据抗生素性质的差异建立的分离纯化方法各不相同，因此采用合理有效的分离纯化技术路线是新型抗生素研究成功与否的关键。本实验采用了各种常用的分离纯化抗生素的方法从海洋微生物提取有抗菌活性的抗生素并希望通过对各种方法进行优化处理找到更好的分离纯化方法以在获得新抗生素资源的同时获得较高的产率。参考文献【1】焦炳华，穆军，许强芝，缪辉南，抗感染药学Anti- infection pharmacy 2004年6月第1卷第1期海洋微生物来源新抗生素的研究【2】谢则平，海洋厌氧细菌SRB