河南工业大学生物化学考研第01章绪论第02章蛋白质构件----氨基酸

第二章蛋白质的构件 氨基酸 蛋白质 英文为 Protein 第一重要 第一节 蛋白质的组成与结构 1 1蛋白质的元素组成 主要由C H O N四种元素组成 大多数蛋白质还含有S 有些结合蛋白质含有p Fe Cu Mg Zn等样品中蛋白质含量 含氮量称作蛋白质系数 蛋白质的平均含氮量接近16 蛋白质含量 蛋白氮x6 25动物蛋白质系数为6 25 植物在5 7左右 1 2蛋白质的分类 一 依据蛋白质的外形分类球状蛋白质 纤维状蛋白质 球状蛋白质 globularprotein外形接近球形或椭圆形 溶解性较好 能形成结晶 大多数蛋白质属于这一类 纤维状蛋白质 fibrousprotein分子类似纤维或细棒 又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质 二 依据蛋白质的组成分类按照蛋白质的组成 可以分为简单蛋白 simpleprotein 和结 缀 合蛋白 conjugatedprotein 简单蛋白又称为单纯蛋白质 这类蛋白质只含由 氨基酸组成的肽链 不含其它成分 1 清蛋白和球蛋白 albuminandglobulin广泛存在于动物组织中 清蛋白易溶于水 球蛋白微溶于水 易溶于稀酸中 2 谷蛋白 glutelin 和醇溶谷蛋白 prolamin 植物蛋白 不溶于水 易溶于稀酸 稀碱中 后者可溶于70 80 乙醇中 3 鱼精蛋白和组蛋白 碱性蛋白质 存在与细胞核中 4 硬蛋白 存在于各种软骨 腱 毛 发 丝等组织中 分为角蛋白 胶原蛋白 弹性蛋白和丝蛋白 结合蛋白由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成 糖蛋白 由简单蛋白与糖类物质组成 如细胞膜中的糖蛋白等 脂蛋白 由简单蛋白与脂类结合而成如血清脂蛋白核蛋白 由简单蛋白与核酸结合而成 如细胞核中的核糖核蛋白等 磷蛋白 与磷酸基结合金属蛋白 与此同时FeCuZnMn等结合血红素蛋白 亚铁原卟啉黄素蛋白 黄素核苷酸 FMN FAD 三 按功能分类p721 酶类2 调节蛋白3 转运蛋白4 贮存蛋白5 收缩和游动蛋白6 结构蛋白7 支架蛋白 SH2组件 8 保护和开发蛋白 第二节 氨基酸 2 1氨基酸的种类与结构 含有氨基的羧酸 一 化学结构R CH NH2 COOHR代表氨基酸之间相异的部分 叫R基 Rgroup 又称为侧链 sidechain 无色晶体 溶于水 酪氨酸分子 地球上天然形成的氨基酸有300种以上 但是构成蛋白质的氨基酸只有20种 且都是 氨基酸 可能还存在更多的 提问 什么是 氨基酸 答案 C C C C COOH C C C C NH2 COOH 氨基酸 C C C NH2 C COOH 氨基酸 C C NH2 C C COOH 氨基酸 旋光性 可使偏振光平面发生旋转不对称碳原子 碳原子所连的4个碳原子不相同构型 不对称碳原子周围的取代基在空间上的排列20种氨基酸除甘氨酸外都具有旋光性除甘氨酸 Gly 外 C都是不对称碳原子 且都为L 构型构型的改变需要共价键的的破坏与重新形成 与氢键无关 氨基酸的L D 型都是以甘油醛为标准确定的 2 1 1 氨基酸的旋光性与构型 甘油醛投影式和透视式 L 氨基酸的结构通式 二十种氨基酸除Gly外全是L 构型 碳原子的四面体结构 L 构型与D 构型 脯氨酸 Pro 不含游离的氨基 为亚氨基酸半胱氨酸 Cys 和蛋氨酸 Met 含有S元素 2 1 2 常见的蛋白质氨基酸 二十种氨基酸的结构 2 1 3 不常见的蛋白质氨基酸 由常见的蛋白质氨基酸经化学修饰而成常见的是羟基氨基酸和甲基氨基酸 锁链素 R 羟基谷氨酸存在于凝血酶原中 存在于弹性蛋白中 4 羟脯氨酸存在于胶原蛋白中 存在于肌球蛋白中 不常见的蛋白质氨基酸 2 1 4 非蛋白质氨基酸 各种生物分离到的氨基酸已达250种以上激素 代谢中间产物 毒素 抗菌素等 鸟氨酸 瓜氨酸 2 1 5 蛋白质氨基酸的分类 按侧链 R 的性质 常见的蛋白质氨基酸被分为四类 1 非极性R基氨基酸 共8种 丙氨酸 Ala 缬氨酸 Val 亮氨酸 Leu 异亮氨酸 Ile 脯氨酸 Pro 色氨酸 Trp 甲硫氨酸 Met 苯丙氨酸 Phe 2 无电荷的极性R基氨基酸 共7种 丝氨酸 Ser 苏氨酸 Thr 酪氨酸 Tyr 半胱氨酸 Cys 天冬酰胺 Asn 谷氨酰胺 Gln 甘氨酸 Gly 3 带正电荷的极性R基氨基酸 共3种 赖氨酸 Lys 精氨酸 Arg 组氨酸 His 4 带负电荷的极性R基氨基酸 共2种 天冬氨酸 Asp 谷氨酸 Glu 带正电荷侧链氨基酸 带负电荷侧链氨基酸 上节课总结 蛋白质的组成与结构 三种分类方法 氨基酸的种类与结构 2 1 6 必需氨基酸 人和动物维持正常生理功能所必需 而又不能自身合成的氨基酸称为必需氨基酸 essentialaminoacids 必需氨基酸包括赖氨酸 苯丙氨酸 蛋氨酸 亮氨酸 异亮氨酸 缬氨酸 苏氨酸 色氨酸 组氨酸和精氨酸 其中组氨酸和精氨酸 人虽然能合成 但效率低 尤其在婴幼儿时期 需要由外界供给 2 2氨基酸的性质 2 2 1 氨基酸的溶解性和光吸收无色晶体 熔点较高 200 300 溶于水而不溶于非极性的有机溶剂 但不同的氨基酸在水中的溶解度差别很大如亮氨酸 异亮氨酸 缬氨酸是疏水性的 其他氨基酸如赖氨酸 组氨酸 精氨酸是亲水性的 除Gly外 都具有旋光性在可见光区没有光吸收 三种芳香族氨基酸 色氨酸Trp 酪氨酸Tyr 苯丙氨酸Phe 在紫外光区有光吸收 最大吸收峰在280nm处 2 2 2 氨基酸的两性解离氨基酸分子中既含有酸性的 COOH 又含有碱性的 NH2 属两性离子 带相反电荷的极性分子叫做两性离子或偶极离子 COOH的pK 2左右 NH2的pKa 9左右 pK解离常数的负对数 Arg pKa 12 5 Lys pKa 10 5 His pKa 6 0 Asp pKa 3 9 Glu pKa 4 3 Cys pKa 8 3 Tyr pKa 10 1 Ser pKa 13 Thr pKa 13 H2N 纯晶体状态 COO H3N 水溶后等电荷状态 总电荷0 加酸 总电荷 加碱 H2N COO H3N OH H2O H2N 总电荷 氨基酸的两性解离 氨基酸的等电点 当氨基酸所带正电荷与所带负电荷相等时 溶液的PH值为这一种氨基酸的等电点 PI 在酸性溶液中在晶体状态或水溶液中在碱性溶液中即等电点 pI 不带电 pI 等电点时的pH K1和K2分别代表 碳原子上的 COOH和 NH3的表观解离常数 共轭酸共轭碱 共轭酸共轭碱 Handerson Hasselbalch公式 pH pKa lg A HA pKa lg 碱 酸 可计算出在任一pH条件下一种氨基酸的各种离子的比例 氨基酸的带电状况与溶液的pH值有关 表 氨基酸的酸碱化学 甘氨酸的滴定曲线 PK1 PK2PI 2 谷氨酸的滴定曲线 PK1 PK2PI 2 赖氨酸的滴定曲线 PK2 PK3PI 2 组氨酸的滴定 解离 曲线p21 组氨酸 氨基酸的PK值和等电点 p21 等电点的计算p22 1 侧链不含解离基团的中性氨基酸pI pK1 pK2 22 侧链含有可解离基团的氨基酸酸性氨基酸 pI pK1 pKR 2碱性氨基酸 pI pK2 pKR 2半胱氨酸 pI pK1 pKR 2 R有电性区别 中性氨基酸pI一般为6 0提问 为什么偏酸性 答案 COOH解离程度略大于 NH2的得电子能力提问 酸性氨基酸的pI 更偏酸 更偏碱 更酸 3 0左右 碱性氨基酸pI更碱 7 6 10 7 只有三种 提问 大多数氨基酸在中性水溶液 pH 7 时 带电 不同氨基酸等电点 pI 不同提问 为什么 2 2 3 氨基酸的化学反应 1 氨基参加的反应p48 50 酰基化烃基化反应 酰基化反应p48 丹磺酰氯 DNS CL 与氨基酸反应生成荧光性质强和稳定的磺胺衍生物 用途 可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸 烃基化反应 2 4 二硝基氟苯 FDNB Sanger试剂 在弱碱性溶液中与氨基酸发生取代反应 生成黄色化合物二硝基苯基氨基酸 p48 苯异硫氰酸酯 PITC 在弱碱性条件下 与氨基酸反应生成苯乙内酰硫脲衍生物 此反应又称之Edman反应 氨基酸序列测定常用的反应p50 2 羧基参加的反应p23成酯与成盐反应酰氯化与酰胺化反应 3 氨基和羧基共同参加的反应p23 茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸共热 具有游离氨基的氨基酸都生成紫色化合物 脯氨酸是一个亚氨基酸 生成黄色化合物 紫色 与茚三酮的反应 形成肽键 4 侧链具有的反应p24形成二硫键 成酯反应 第三节 氨基酸的分离与分析p25 3 1 分配层析分配层析是利用混合物中各组分在两种不同溶剂中的分配系数不同而使物质分离的方法 利用被分离样品混合物中各组分的化学性质的差异 使各组分以不同程度分布在两个相中 这两个相一个为固定相 另一个为流动相 当流动相流进固定相时 由于各组分在两相中的分配情况不同或电荷分布不同或离子亲和力不同等 而以不同的速度前进 从而达到分离的目的 CA 一种物质在A相 流动相 中的浓度CB 一种物质在B相 固定相 中的浓度 分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中的溶解达到平衡时 该溶质在两种溶剂中所具有浓度之比 不同的物质因其在各种溶剂中的溶解度不同 因而也就有不同的分配系数 分配层析中应用最广泛的多孔支持物是滤纸 其次是硅胶 硅藻土 纤维素粉 淀粉和微孔聚乙烯粉等 一般分为 柱层析 纸层析 薄层层析 柱层析分离就是常说的过柱子 也叫柱色谱 将固定相装于柱内 使样品沿一个方向移动而达到分离 常用于溶液中蛋白质混合物的分级分离 柱层析p27 填充物 亲水性的不溶物质 如纤维素 淀粉 硅胶等 洗脱剂 与水不互溶的溶剂 如苯酚 正丁醇等 层析柱 纸层析 纸层析是以滤纸为隋性支持物 滤纸纤维和水有较强的亲和力 在一般条件下较难脱去 而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力甚弱 所以一般的纸层析实际上是以滤纸纤维的结合水为固定相 以有机溶剂为流动相 原理 1 是分配层析的一种 在纸上水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相 当有机相沿纸流动经过层析点时 层析点上溶质就在水相和有机相之间进行分配 溶质中各组分的分配系数不同 移动速率也不同 因而可以彼此分开 2 氨基酸与茚三酮的显色反应 3 物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值来表示的 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数 Rf 4 Rf值的大小与物质的结构 性质 溶剂系统 PH层析滤纸的质量和层析温度等因素有关 5 上层层析 下层层析 单向层析 双向层析 1 将盛有扩展剂10ml的小烧杯和培养皿置于密闭的层析缸中 2 戴手套取层析滤纸一张作标记 3 点样 干后重复点一次 直径最大不超过3mm 缝成筒状 两边不能接触 点样面朝外 点样端朝下 盖上层析缸盖 平衡约20 30分钟 4 展层用长颈漏斗 扩展剂的液面需低于点样线1cm 上沿约1厘米时 取出滤纸 用铅笔标出溶剂前沿界线 干燥 5 显色用0 1 茚三酮丙酮溶液均匀浸透 烘箱 65 5分钟或用热风吹干 脯氨酸 羟脯氨酸产生黄色物质外 所有 氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮产生兰紫色物质 离子交换层析是分离分析氨基酸的有效方法离子交换剂共价地结合许多可解离为阴离子或阳离子的基团 可以与周围溶液中的其它相反离子或离子化合物结合 当把被分离的氨基酸混合物的溶液调至pH3 0时 氨基酸都带净正电荷 但由于每种氨基酸的电离状态不同 因而它们的净正电荷的程度也不同 故被洗脱下来的速度也不相同 除了电荷作为主要分离因素外 氨基酸侧链与树脂的非极性骨架之间的相互作用也是影响分离的因素 现在常用高效液相层析 HPLC 代替普通的离子交换层析 3 2 氨基酸的离子交换层析p27 离子交换树脂基质 是具有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯 单体 苯二乙烯 交联剂 进行聚合和交联反应生成的具有网状结构的不溶性的高分子化合物 树脂一般都制成 球形的颗粒 带电基团 是通过化学反应引入基质 有阳离子和阴离子两种交换树脂 阳离子交换树脂与阴离子交换树脂 氨基酸与树脂的亲和力 取决于它们之间的静电吸引和氨基酸侧链与树脂基质之间的疏水相互作