抗生素发酵染菌原因及解决方法

浅浅谈谈抗生素抗生素发发酵染菌原因及酵染菌原因及预预防方法防方法 生产抗生素通常采用微生物纯种培养 培养过程中只允许特定的微生物生 长 如果发酵过程中除抗生素产生菌以外还有其他微生物存在 染菌 就会影响 抗生素产量和质量 抗生素发酵在生产中常常因操作环节复杂而更容易染菌 笔 者在长期的生产实践中积累了一些经验 对避免发酵染菌及查找染菌原因具有 一定的指导作用 1 染菌的原因及染菌的原因及预预防方法防方法 1 1 摇瓶 斜面 种子带菌导致一级种子罐染菌 摇瓶 斜面 种子制备过程中 如果存在母瓶 母斜面 培养基和子瓶 子斜面 培 养基灭菌不彻底或菌种操作人员在净化工作台中进行母瓶 母斜面 子瓶 子斜 面 接种及并瓶时无菌操作不规范或摇瓶种子培养环境不洁净等现象就会造成摇 瓶 斜面 种子带菌而导致一级种子罐染菌 预防方法 菌种制备过程中首先要保证配制的培养基没有较大颗粒 培养基灭菌时要 保证蒸汽流动 做到压力计和温度计的准确一致性 防止假压形成 为防止灭菌后 培养基二次染菌 应尽量做到培养基即灭菌即使用 无菌操作时保证无菌室用前 彻底灭菌 所用器具不带菌 操作时无菌物品在上风处 带菌 或可能带菌 物品 在卜风处 操作人员少说话 避免咳嗽 打喷嚏及其他大幅度动作 无菌室管理按照 GMP 有关洁净区的要求进行 定期检测沉降菌 浮游菌 摇瓶间按洁净区管理 摇瓶间是摇瓶种子母瓶 子瓶培养的场所在培养过程 中瓶塞上往往会附着尘埃 在接种 并瓶等无菌操作过程中拔瓶塞时灰尘很容易 落进瓶内 造成种子带菌 要想实现摇瓶种子无杂菌 保持摇瓶间的清洁是非常 关键的 应当把摇瓶间当做洁净区区进行管理 每日坚持用干净湿抹布擦拭摇瓶 间的地而及墙而 在充分消除对培养种子影响的情况不定期用消毒液如双氧水等 对摇瓶间进行消毒 1 2 一级种子管接种操作不当染菌 火焰接种会导致一级种子罐染菌种子罐接种时 除按要求进行室内消毒外 还需要消毒人员与接种人员密切配合 快 准 稳地完成操作过程 否则易导致 接种失败 预防方法 进行一级种子罐接种 一是压差接种法 二是零磅接种法 当采用零磅法接种 时 罐压瞬时为零 外界空气就有可能从设备的泄漏处 如轴封等 及接种口进入 罐内造成染菌 因此 保持一级罐接种区的洁净度也是减少染菌的有效方法 应 当做到 一级种子罐要有单独的区域同其他生产区隔离 保持一级种子罐区的环境 卫生 一级种子罐区门窗日常应处于密闭状态 每次接种前用消毒液喷雾消毒 环 境定期用高锰酸钾熏蒸消毒 有些公司将一级种子罐的接种口放置在无菌室内的净化工作台前 效果良 好 1 3 蒸汽质量造成的染菌 由于受各方面因素影响 蒸汽质量波动很大 有时蒸汽中冷凝水含量很高 总蒸汽压力较低 并且压力波动很大 温度低 这种蒸汽属于湿饱和蒸汽 灭菌 效果较差 很容易造成染菌 预防方法 在生产进度允许的情况下 可采取空消的办法 排除蒸汽中的一部分冷凝水 待蒸汽相对干燥一些后 再正式进罐消毒灭菌 也可以再进罐灭菌之前 开启各个蒸汽灌录上的冷凝水阀门排冷凝水 待蒸 汽中含水量减少之后再进罐 以上只是应急措施 要从根本上解决蒸汽中冷凝水的问题 还必须从蒸汽锅 炉的设计容量 系统管路的合理安装 管道的保温等方面去解决 需要特别注意 的是消毒蒸汽管路不能连接非消毒设施 如采暖设备 职工澡塘的蒸汽 否则会 造成发酵车间蒸汽压力下降和波动 甚至有菌物料和蒸汽的串连 因这种原因造 成的染菌在很多厂家都发生过 1 4 空气系统引起的染菌 过滤器失效会导致染菌因空气系统带菌而导致罐染菌的机率较高 空气系 统容易出现的问题是 无菌空气带油带水 空气过滤器质量和高效滤芯的安装质 量等几个方面 无菌空气中带油多来自往复式空气压缩机上 解决这个问题 首 先应从采用无油润滑空压机着手 无菌空气带水 主要是由压缩后的高温空气 经突然冷却后产生的 除水设备泄漏 设计不合理或是失效是空气带水的主要原 因 预防方法 增加必要的除油除水设备 特别要注意定期排水 尤其是湿度大的阴雨天气 采用无油润滑的空压机 从根本上解决 若无法改造 可以在总空气过滤器 上填充活性炭或玻璃棉减少油雾阻力 空气过滤器滤芯要采用质量较好的厂家的产品 使用尘埃粒子计数器等检测仪器和生物鉴定方法对过滤器是否失效进行准 确 及时的判断 安装高效过滤器要注意以下几点 高效过滤器的灭菌管路 一定要经过减压 温压 粗滤处理 高效过滤器的空气进出口管路上安装监测口 安装前一定要仔 细检查卡口与 O 形圈的配合尺寸 一般一个季度做一次检查 发酵过程中染菌后 要根据菌型判断杂菌的来源 不能草率的拆卸高效过滤器 1 5 降温设备泄漏和堵塞 发酵罐夹层和蛇形管的穿孔是造成染菌的主要原因之一 冷水阀门内漏 夹套 蛇管 排水阀门堵塞也是造成染菌的主要设备因素 预防方法 在冷却设备制作过程中 应当选用不锈钢材质未原料进行冷却设备的加工 制造 冷却设备制造结束 应当进行严格个试漏检查 并应当进行射线探伤检查并 拍片 发酵车间应当建立冷却设备的定期检查及试压 试漏制度 发酵罐必须每批下罐进行罐内设备的检查 防止蛇形管定位卡松动而造成 穿孔泄漏 1 6 培养基带菌导致罐染菌 培养基颗粒过大会导致灭菌不彻底 培养基灭菌操作不到位导致灭菌不彻 底培养基在灭菌过程中 对预热时间 蒸汽阀门的开度 灭菌温度 灭菌压力和 泡沫控制等 都有严格要求 一个环节出现问题 就容易导致染菌 预防方法 培养基配制时应充分搅拌 并在输料管道上安装管道过滤器 以防止大颗粒 固形物进入种子罐造成培养基灭菌不彻底 若种子罐较小 配料量较小的情况下 最好将原料过筛 可有效防止此种情况 灭菌前全面检查设备 消除灭菌死角 根据设备大小决定灭菌预热时间 培养 基灭菌时其蒸汽压力不得低于 0 3 MPa 根据培养基初始温度的不同决定阀门的 开启程度 灭菌过程中应保证与培养基相接触的管道大进蒸汽 与培养基不接触 的管道小进蒸汽 防止出现假压 要同时观察压力表和温度表 二者应符合对应关 系 如有明显差异 可根据经验判断失灵者 一般以温度计为准 灭菌过程中进 汽阀门应逐渐增大 排汽阀门应逐渐关小 保压灭菌时应保证压力温度稳定 2 染菌的染菌的检查检查 原因分析 原因分析 2 1 染菌的检查与判断 在发酵过程中对杂菌污染的及早发现 及时处理 是免除染菌造成严重损失 的重要问题 因此 要求有确切 迅速的方法来检出杂菌的污染 目前常用方法 主要有以下几种 2 1 1 显微镜检查 通常用革兰氏染色法 染色后在高倍显微镜下观察 根据生产菌与杂菌的 特征区别 判断是否染菌 2 1 2 平板划线培养或斜面培养检查法 先将经灭菌的固体培养基倒入灭菌的平板中置培养箱摄氏 37 度 保温至 少 24h 检查无菌即可使用 将需要检查的样品 在无菌平板上划线 分别置摄氏 37 度 摄氏 27 度培养 以适应嗜中菌和低温菌的生长 一般在 8h 后即可观察 但准确率较低 培养基 PH7 0 葡萄糖 0 5 牛肉膏 1 0 蛋白胨 1 0 氯化钠 0 5 琼脂 1 0 2 1 3 肉汤培养检查法 将需要检查样品接入经灭菌并经过检查无菌的肉汤培养基中 放置摄氏 37 度和摄氏 27 度分别培养 24h 进行观察 并取样镜检 此法常用于检查培养基和 无菌空气是否带菌 此时使用生产菌作为指示菌 葡萄糖酚红肉汤培养基 PH7 2 牛肉膏 0 3 葡萄糖 0 5 氯化钠 0 5 蛋白胨 0 8 1 酚红溶液 0 4 用以上的检查方法检查未发现污染 还不能肯定未被污染 除以上方法外 还可以从发酵过程的异常现象来判断是否染菌 如溶解氧 急剧降低 PH 值剧烈变化 排气中 CO2 含量和菌体酶活力等变化来判断 注 注 有很多情况下 发酵培养基因使用酵母粉 玉米浆等含有大量菌体的物料配 置培养基 显微镜下观察时难以判断 此时应遵循的一个原则是 若培养基染菌 其菌量应逐渐增加 若菌量未增加且菌型与培养基中所含菌形态一致的 应该不 是染菌 需要注意的是 开始染菌时间的判定和菌型的判定是非常关键的 是接种前染菌还是接种后染菌 是补料前染菌还是补料后染菌 是补哪种料 哪批料后染菌 染的是耐热菌型还是非耐热菌型 染的单一菌型还是混合菌型都 是工艺人员判断染菌原因的依据 取样都是在开放环境下进行的 难免有误差出现 为了避免误差 可以增加 取样的频率和数量 特别是种子罐系统 万一出现难以判断的情况 较多的样品 可以增加判断的依据 2 2 发酵染菌原因分析 在发酵染菌之后 必须分析染菌原因 总结发酵染菌的经验教训 把发酵染 菌消灭在发生之前 防患于未然 是积极制服发酵染菌的最重要措施 造成发酵染菌的原因很多 但总结归纳起来 其主要原因有 无菌空气带菌 设备渗漏 灭菌不彻底 操作失误和技术管理不善 在发生染菌后 都要仔细利用显微镜观察培养基无菌斜面和肉汤 前期染菌 要镜检供种方的无菌样 参考表一并参考以下方法进行分析 找出原因 杜绝污 染 表 1 各种微生物生长最适温度 pH 及致死温度 致死时间范围 微生物最适温度 pH致死温度 致死时间 t m in 酵母菌253 8 6 050 605 10 霉菌254 0 5 850 605 10 球菌305 0 7 050 605 10 长短杆菌 376 5 7 56010 芽孢杆菌 376 5 7 51006 17 2 2 1 从染菌时间来看 2 2 1 1 发酵早期染菌 可能原因有 种子带菌 培养基和设备灭菌不彻底 接种操作不当 无菌空气 带菌 发酵后期染菌 可能原因有 中间补料污染 设备渗漏 操作问题 种子带菌 一般根据种子制备过程中的无菌样和接种后剩余种子做的无菌样 进行监测 根据实际情况看 种子带菌多是操作带入 一般为球菌 但笔者也遇 到了菌种因摇瓶培养基未消透而出现染菌的情况 一次为更换了一种原料 其中 有大量杂菌 使用原工艺难以完全灭菌 一次为使用了较大摇瓶 由 750ml 摇瓶 装 80ml 改为 5000ml 摇瓶装量 500 没了 在没有进行验证的情况下使用原工艺 进行灭菌 结果因装量大 摇瓶升温慢 灭菌柜测量的是排气口的温度而不是培 养基的温度 导致摇瓶培养基染菌 需要特别注意的是 若监测种子的无菌样都 正常 就应当立即放弃种子带菌的可能 把精力转移到其他方面去寻找真正的染 菌原因 否则会影响原因的查找 一级种子罐染菌未镜检出带入发酵罐 一般 15 小时内发酵罐就有所表现能 直接在发酵液内看到杂菌 此时 种子罐的无菌斜面可镜检出杂菌 比较好判断 培养基和设备灭菌不彻底 一般情况为芽孢 可根据无菌样品排除各种原因 后判定是否是此种原因 发酵设备的泄漏 尤其是冷却设备的泄漏 夹层 蛇形管或连消装置喷淋冷 却器的穿孔也是发酵前期染菌的主要原因 其菌量的大小一般和泄漏的严重程 度相关 接种操作不当 一级种子罐接种不当 一般根据当天接种人员的反应 无菌 样起染时间判断 一般染球 也有其他菌型 无菌空气带菌 此种情况下 菌型一般比较杂 一般在 2 种或 2 种以上 一般 在消后无菌样就可观察到染菌 定期拆过滤器检修是杜绝此类染菌的办法之一 2 1 2 2 发酵中后期染菌 中期染菌一般从发酵设备的死角 设备的泄漏 补料设备等方面查找原因 也有可能是操作不当比如泡沫顶罐所致 补料罐染菌表现很明显 就是所有运转罐基本在同一时间染菌 且菌型一致 罐体泄漏一般会比较明显 较容易发现 盘管或夹套漏就比较难发现 需要打压 试漏 仔细检查 2 2 2 从污染的杂菌种类来看 污染耐热的芽孢杆菌 可能是培养基或设备灭菌不彻底 污染球菌 无芽孢杆菌等不耐热杂菌可能是种子带菌 设备渗漏 污染霉菌 一般是菌种带菌 罐体大的泄漏或操作问题 2 2 3 从染菌的幅度来看 如果各个发酵罐或多个发酵罐染菌 而且所污染的是同一种杂菌 杂菌的主 要来源可能是空气净化系统 补料系统 蒸汽系统等公共系统 如果只是发酵罐大面积染菌 除考虑空气净化系统带菌外 还要重点考查接种 管道 补料系统 发酵培养基采用连续灭菌工艺时 还要严格检查连消系统是否带 入杂菌 如果各别罐连续染菌 一般是设备问题 以上仅仅是在分析问题时作