徐军-论文-硕士

噬菌体展示甲 乙型流感病毒候选疫苗的构建及其免疫原性研究 研究生 徐军导师 胡云章研究员导师组 胡凝珠主任技师学科专业 生物化学与分子生物学研究方向 病毒疫苗 一 研究背景 二 实验设计 三 结果与讨论 四 小结 研究背景 流行性感冒是一种全球性的呼吸道传染病 每年流行造成大量的病患和死亡 爆发大流行时造成大量的人员伤亡和经济损失 特别是1918年的西班牙流感大流行 人们对此还记忆犹新 AU S ArmyinfluenzawardinLuxembourg duringthe1918epidemic PhotocourtesyNationalMuseumofHealthandMedicine ArmedForcesInstituteofPathology Washington D C 1918 上世纪的流感大流行 1918西班牙流感流行死亡4 5千万人H1N1 1968香港流感流行死亡46 000H3N2 1957亚洲流感流行死亡98 000H2N2 1997 香港首例人感染H5N1 流感病毒属正黏病毒 Orthomyxoviridae 负链RNA病毒 流感病毒 流感病毒可根据核蛋白 RNP 抗原核M抗原分为3类 流感病毒的种类 流感现行的防治策略 到目前为止 疫苗是控制流感流行的最直接有效的方法 现行的药物对流感的预防并不是很有效 但对减少死亡率和防治传播有重要意义 M2inhibitors Neuraminidaseinhibitors 通过有效的公共卫生医疗系统来减少死亡率和阻止传播 胞吞 膜融合 uncoating 出芽 释放 NP RdRp 胞内体 HA NA M2 吸附 新病毒 nucleus M1 NS2 mRNA 复制 转录 翻译 NS1 PB1 F2 疫苗 Neuraminidaseinhibitor 原病毒 金刚烷胺 抗流感药物 流感疫苗 现在市场上使用的流感疫苗多以血凝素 HA 为主要或唯一抗原 血凝素是流感病毒表面唯一能产生中和抗体的抗原 流感病毒的血凝素 HA 和神经氨酸酶 NA 是高度变异的 而且变异多发生在抗体识别位点 为了有效的防止流感的流行 每年根据不断更新的信息生产开发新疫苗来 抗原漂移 antigendrift 由突变引起的小范围的改变 导致小范围的流行 流感病毒表面抗原常见的改变方式之一 流感病毒表面抗原常见的改变方式之二 抗原变异 antigenshift 不同亚型间整个抗原的互换 大范围的改变 引起大范围的流行 中间宿主在新抗原产生的作用 禽病毒 禽病毒 重排病毒 人类病毒 新的大流行 新病毒 HA和NA高变异性 新疫苗 疫苗预防效果下降 新型流感疫苗 广谱的免疫反应 能抑制多种病毒 基于保守的抗原表位 安全可靠易于生产 金刚烷胺 amantadine 的启示 金刚烷胺 amantadine 是三环立体对称的胺基化合物 作为常用的抗流感药物特异的抑制甲型流感病毒 金刚烷胺是被认为是通过抑制质子通道蛋白M2来发挥作用的 M2蛋白是否可以成为新的疫苗表位呢 甲型流感病毒中的M2蛋白 M2蛋白是病毒基因编码的具有质子通道的膜蛋白 M2蛋白在被感染的细胞表面大量表达 M2蛋白是启动病毒复制所必需的 病毒以胞吞作用方式进入细胞的胞内体 endosome 中 M2蛋白质子通道在胞内体的酸性环境下被酸化激活打开 促使病毒与胞内体膜融合 将病毒遗传物质释放到胞浆内 病毒开始复制 mRNA NS1 PB1 F2 吸附 原病毒 胞吞作用 膜融合 endosome 释放 nucleus HA NA M2 Transcription replication translation M1 NS2 出芽 释放 新病毒 流感的生活史 M2蛋白的胞外区 M2e 是由M2蛋白N端23氨基酸序列组成的 高保守 M2e能诱发针对于多种甲型流感病毒的广谱交叉免疫保护反应 M2蛋白的M2e AminoacidsequenceofM2e Liu Lietal 2003 M2e 保守的IVA抗原 SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDSLLTEVETPTRNEWGCRCNDSSDSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDSLLTEVETPIRSEWGCRCNDSSDSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSNSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSNSLLTEVETPIRKEWGCRCNDSSDSFLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDSLLTEVETPIRNEWECRCNGSSDSLPTEVETPIRSEWGCRCNDSSDSLLTEVETPIRNGWECKCNDSSDSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD consensusM2esequenceA Brevig Mission 1 1918H1N1A PuertoRico 8 1934H1N1A Chile 13 1957H2N2A Japan 170 1962H2N2A AnArbor 7 1967H2N2A Aichi 2 68H3N2A England 878 1969H3N2A Caracas 1 1971H3N2A Taiwan 3 71H3N2A Aichi 69 1994H3N2A Wuhan 359 95H3N2A Wisconsin 10 98H1N1A NewYork 497 2003H1N1A NewYork 378 2005H3N2 人A型流感病毒株 HxNy mRNA NS1 PB1 F2 吸附 原病毒 胞吞作用 膜融合 endosome 释放 nucleus HA NA M2 Transcription replication translation M1 NS2 出芽 释放 新病毒 M2抗体 无M2的新病毒 乙型流感病毒中的BM2蛋白 BM2蛋白是乙型流感病毒四种膜内在蛋白之一 表达于被感染的细胞表面 BM2蛋白具有质子通道功能 其跨膜区与甲型流感病毒M2蛋白结构相似 BM2是感染性乙型流感病毒产生所必需的 在病毒组装过程中 被感染细胞细胞膜上的BM2将M1 vRNP复合体捕抓到病毒颗粒出芽位点 噬菌体展示新型疫苗 优势 易于构建多价疫苗 纯化简单 花费少 噬菌体颗粒稳定 噬菌体募集T辅助细胞 噬菌体是免疫佐剂 表达天然构象产物 二 实验设计 噬菌体微球候选疫苗的构建 多表位基因的拼接基因片断T载体的连接T7噬菌体的包装 扩增和灭活噬菌体微球疫苗制备 2 候选疫苗免疫效果分析 候选疫苗三次免疫ELISA检测抗体IgG活性三种流感病毒攻击呼吸道病毒存量检测分析疫苗的保护作用 EcoRI EcoRV 多表位基因片断 EcoRI EcoRV pGEM T TT Ifv T Ifv ifv 连接 MCS T7select10 3b 双酶切后ifv T和T7连接 EcoRI EcoRV IFV T7 0 14 30 时间 感染 103pfu 免疫 血清取样 候选疫苗免疫效果研究 14 30 1 3 5 7 9 11dpi病毒检测 and 三 结果与讨论 一 噬菌体微球流感疫苗的构建 1 多表位基因PCR拼接 图1多表位PCR拼接鉴定 图2多表位拼接产物测序图 2 多表位基因连接T载体 图3重组质粒双酶切鉴定 3 重组噬菌体PCR鉴定 图4重组噬菌体PCR鉴定 图5重组噬菌体PCR产物测序 二 候选疫苗免疫保护效果分析 1 疫苗表位IgG抗体分析 图6表位IgG抗体分析 2 疫苗对H3N2感染保护性分析 图7疫苗对H3N2感染的保护 3 疫苗对H1N1感染保护性分析 图8疫苗对H1N1的感染保护性分析 4 疫苗对B流感病毒感染的保护性分析 图9疫苗对B流感病毒感染的保护性分析 四 小